Способ конфокального сканирования трёхмерных микрообъектов был предложен ещё в 50-х годах прошлого столетия [1], но первые коммерческие 3D-микроскопы появились только к концу 80-х. В настоящее время наибольшее распространение получила лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (LSCM — Laser Scanning Confocal Microscopy) [2]. Объёмное изображение в LSCM получается при помощи регистрации флуоресценции в фокусе лазерного луча. Излучаемые фотоны фокусируются объективом на небольшом ("pinhole", ~50 µm) отверстии, которое ослабляет флуоресцентный сигнал от участков, находящихся не в фокусе (рис. 1).

Устройство современных LSCM-микроскопов намного сложнее и включает лазерные модули, несколько фотоумножителей (PMT), акустооптические туннельные фильтры (AOTF), светоделительные пластинки, сканерный модуль и многое другое (рис. 2).

Подобное усложнение обеспечивает широкий выбор спектральных линий когерентного освещения и возможность параллельной регистрации флуоресценции с различными длинами волн. Скорость сканирования зависит от разрешения и у микроскопа LCM 510 при разрешении 512х512 составляет примерно 1/5 секунды на слой [3]. При максимальном разрешении 2048х2048 сканирование каждого слоя занимает более секунды и считывание объёмного изображения может продолжаться десятки минут.

Максимальная глубина сканирования при использовании объективов с минимальным увеличением и водной иммерсией достигает 3-4 mm, что вполне приемлемо для не слишком толстых образцов, но для сканирования крупных объектов с высоким разрешением необходима панорамная съёмка объёмных блоков с последующей компьютерной стыковкой нескольких десятков или сотен трёхмерных изображений. Даже при минимальном разрешении микроскопа продолжительность такого сканирования будет измеряться часами, что неприемлемо для большинства биологических объектов.

Значительно более высокая скорость сканирования характерна для SDCM (Spinning Disk Confocal Microscopy) [4]. В микроскопах подобного типа используется вращающийся диск с тысячами отверстий. Его прототипом стало датируемое ещё 1884 годом изобретение германского учёного Paul Nipkow, обеспечивающее передачу изображений на расстояние. Принцип такой передачи показан на рис. 3.

Современный аналог Nipkow-диска содержит 20 тысяч расположенных по спирали отверстий, причём лазерный луч фокусируется на них при помощи дополнительного диска с 20 тысячами микролинз. При вращении такого двойного диска объект сканируется сразу множеством (~1000) световых фокусов, обеспечивая считывание 360 кадров (плоскостей) в секунду [5] или даже 1 кадр за миллисекунду [6]. Схема этого устройства показана на рис. 4.

Каждый оптический фокус, образуемый парой микролинза-отверстие и объективом, при вращении диска перемещается по слегка искривлённой (дуговой) траектории. Линзы и отверстия расположены на диске по спирали, поэтому траектория каждого следующего фокуса немного смещена и вращение диска обеспечивает сканирование всей фокальной плоскости объекта. Регистрирующим устройством в такой системе служит камера с CCD-матрицей, на которой конфокальная оптика формирует изображение перемещающихся фокусов.

Дисковым сканирующим микроскопам присущи два основных недостатка. Первый связан с необходимостью точной синхронизации скорости вращения диска (1800 об./мин. у CSU10) и частоты считывания сигнала CCD. Без такой синхронизации на изображении появляются многочисленные полосы. В последней модели дисковой системы корпорации Yokogawa (CSU22) предусмотрена возможность варьирования скорости вращения диска, упрощающая настройку микроскопа [7].

Вторая проблема заключается в недостаточной чувствительности обычных CCD при высоких скоростях сканирования и необходимости применения ICCD (Intensified CCD), имеющих встроенный фотоумножитель, или EMCCD (Electron Multiplying Charge-Coupled Device), способных работать в режиме счётчика фотонов [8]. Это существенно повышает стоимость регистрирующей системы.

Общим недостатком сканирующих микроскопов типа LSCM и SDCM является заметная фоновая флуоресценция объектов, находящихся не в фокусе лазерного луча. Внефокусная флуоресценция отфильтровывается находящимся перед регистрирующим устройством микроотверстием, но далеко не полностью. Белее контрастные объёмные изображения можно получить при помощи сканирующей двухфотонной или мультифотонной (MPE - MultiPhoton Exitation) микроскопии.

В MPE-микроскопах флуорофоры возбуждаются только в фокусе лазерного луча, где благодаря высокой концентрации фотонов возможно суммирование их энергии [9]. Например, в микроскопе LSM510 NLO (Carl Zeiss, Германия) флуорофоры с максимумом поглощения в районе 400 nm могут возбуждаться лазерным лучом с длиной волны 800 nm, а фемтосекундный лазер "t-Pulse" с длиной волны около 1030 nm (Pro-Lite, Великобритания) [10] позволяет получить две основные спектральные линии возбуждения: ~500 nm (двухфотонную) и ~340 nm (трёхфотонную). При двухфотонном или мультифотонном возбуждении флуоресценция вне фокуса отсутствует (рис. 5).

Источниками освещения в MPE-микроскопах служат фемтосекундные лазеры. Их общая мощность сравнительно невысока, но концентрация световой энергии в коротких импульсах позволяет значительно повысить эффективность двухфотонного возбуждения флуорофоров, которая пропорциональна квадрату плотности энергии светового потока. Нелинейность зависимости MPE от интенсивности освещения обеспечивает максимальную флуоресценцию центральной части светового фокуса и повышает разрешающую способность микроскопов этого типа и контрастность изображения (рис 6).

Благодаря отсутствию внефокусной флуоресценции MPE-микроскопы могут работать без обычного для LSCM фильтрования света через микроотверстие. В мультифокусных системах сканирования (SDCM) при мультифотонном возбуждении флуорофоров диск с отверстиями тоже излишен. Достаточно одного диска с микролинзами (рис. 7) .

Современные 3D-микроскопы, как правило, способны работать и в обычном, и в MPE режимах. Кроме того, в них сохраняется возможность визуального наблюдения сканируемых объектов. Следствием является непомерная (для России) стоимость приборов данного типа. Тем не менее, некоторые крупные институты РАН (ИТЭБ в Пущино; ИБГ, ИБР, ИБХ и ОИЯИ в Москве; ИЦ и ИАнП в Санкт-Петербурге) уже обзавелись импортными сканирующими микроскопами, в том числе мультифотонными. Получаемые с их помощью виртуальные трёхмерные изображения высокого разрешения позволяют заглянуть в микромир и по информативности несопоставимы с обычными двухмерными картинками, но даже при минимальной базовой комплектации сканирующих микроскопов это "удовольствие" стоит сотни тысяч долларов.

В России сканирующие лазерные микроскопы были разработаны в ГОИ им. С.И. Вавилова (Санкт-Петербург) [12] и в СКБ Института радиотехники и электроники РАН (Фрязино) [13]. Проводится разработка конфокального микроскопа с субмикронным разрешением (мультифотонного?) на кафедре Оптических информационных технологий НГТУ (Новосибирск) [14]. К сожалению, отечественные разработки пока никак не повлияли бурное развитие 3D-микроскопии, наблюдаемое во всём мире.

Список литературы