Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Raido Москва |
Помогите, пожалуйста, разобраться! 1) Работаю с белком 170 кДа (то есть вырезаю полоску по маркеру: от 130 до 250 кДа). Однако перенос на PVDF-мембрану маркера 250 кДа происходит не всегда эффективно (при всех равных условиях: ток 60 мА, перенос - 2 ч, в буфере для переноса 10 % этанол). То есть вчера перенос прошел полностью, а сегодня - приблизительно на 60 % (по интенсивности). Существует ли логическое объяснение наблюдаемому явлению? 2) При детекции с использованием 2-х антител с пероксидазой хрена столкнулась со следующей проблемой: после проведения 1 минутной реакции с перекисью, люминолом и кумаровой кислотой, без промедления закладываю пленку. При экспонировании 5 сек на пленке наблюдаются все бенды, а при увеличении времени экспонирования до 1 мин - бендов, соответствующих дорожкам в середине, уже нет!! Аналогичная картина и при 5 мин! Полоски физически не деформировались и не смещались. Куда "пропали" бенды и почему так быстро? Проблема в антителах? (Разведение вчерашнее, но сами антитела старенькие - им больше года). Хотя две недели назад, используя эту же систему детекции (и антитела), я получила отличную картинку. В общем, мистика какая-то...%) |
Nameless Постоянный участник CA |
|
Belousoff Участник Москва |
Есть в вестерне такая вещь как выгорание сигнала - с ней вы и столкнулись. Обычно это происходит при значительном избытке первичных или вторичных антител. Собственно то, что после 5-секундной экспозиции у вас уже видны все нужные бэнды, говорит о том, что антител можно брать в разы меньше. Подкорректируйте разведения первичных и вторичных АТ так, чтобы оптимальная картинка получалась после 30-60-секундной экспозиции - в этом случае сигнал будет выгорать гораздо медленнее, и вы сможете спокойно сделать fine-tuning времени экспонирования. |
Guest IP-штамп: frwzUkJeG5fZ. гость |
Да! Например поменялась площадь фильтровашки(ватмана) в полусухом переносе. Или у вас происходит неравномерный перенос по площади элетродов и вы кладете гель в разные места электродов. |
Raido Москва |
|
Marinka Ts |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Попробуйте почитать про аналог у Роша. (Вообще я сильно подозреваю что АВ впродает или производит по лицензии Роша). ЩФ работает гораздо медленнее ПХ поэтому засвечиваться можно оставлять на ночь. |
Statin Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frTTCS0/dAHf2 гость |
Ваш вопрос не имеет отношения к блоту и к специалистам Краткий ответ: в магазине. |
angel eyes The bad Россия, Е-бург |
|
Statin Постоянный участник |
Если можно ссылочку, заранее спасибо. |
lna Новосибирск, Paris |
на SDS-геле не вижу классического бромфенолового синего фронта. напротив, краска идет в каждой дорожке отдельным бэндом, много выше предполагаемого фронта. маркер (prestained) разделяется как на картинке производителя.. единстевнное, есьб ощущение, что форез идет бытсрее, чем надо. это все сразу выкинуть или помучаться? |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
1.Можно ли PBS в используемых растворах заменить на воду mQ? Если да, то в каких? 2.После забивки, промывки RB, отмывки в спирте и высушивания, можно ли хранить мембрану, если да, то какое время и при каких условиях? Спасибо! Сообщение было отредактировано akimovster - 06.10.2009 05:21 |
guest: ммм IP-штамп: frCNCa5alkkCM гость |
Можно, в тех, в которых это не скажется на качестве. -2.После забивки, промывки RB, отмывки в спирте и высушивания, можно ли хранить мембрану, если да, то какое время и при каких условиях? Можно. При комнатной температуре между двух фильтровашек под прессом. До тех пор пока там еще, что-то можно окрасить. Иван! Каков вопрос таков ответ. Если хотите получить что-то вразумительное, пишите вразумительно: используйте меньше сокращений и описывайте подробнее и конкретнее интересующую вас ситуацию. |
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
- Хорошо. Ситуация такая: хочу секономить PBS. 1.Можно ли после переноса хранить мембрану несколько дней не в растворе PBS, а в автоклавированной воде mQ? 2.Можно ли для промывки использовать 0.05% tween-20 / в воде? 3.Можно ли антитела разводить в 0.05% tween-20 / в воде? Не повлияет ли это деструктивно на белки, антитела и мембрану? Спасибо! |
angel eyes The bad Россия, Е-бург |
Нашли на чем економить Ну лень делать ПБС сделайте ТБС 50мМ трис 150мМ соли 7.5 Мембрану после переноса можно хратить просто завернув в саран и на +4. Про остальное я не експериментировал, а то економия выдет дополнительными рас ходами |
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
(guest: ммм @ 14.07.2008 19:51) 0.5% БСА в PBS, молоко - тоже... |
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Угу! Тоже! 5% молоко можно даже 10%. -Товарищи! Можно ли замораживать водный раствор (в PBS)БСА? Спасибо! Можно, можно если вы его для забивки используете, но лучше сделать сток 10%, он так на морозе лучше хранится. |
smmuscle Участник |
(guest: ммм @ 26.11.2009 17:23) -0.5% БСА в-Товарищи! Можно ли замораживать водный раствор (в PBS)БСА? Спасибо! Можно, можно если вы его для забивки используете, но лучше сделать сток 10%, он так на морозе лучше хранится. И лучше открутить после разморозки, чтобы удалить аггрегировавший БСА (15000g) |
plotter Постоянный участник Стыдно признаваться о том, где живу... |
В принципе работает и без него, но просто любопытно стало... Сообщение было отредактировано plotter - 20.01.2010 16:57 |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
И Вот почему кобальт образует окрашенные комплексные соединения с продуктом окисления ДАБ в результате повышается глубина окраски и чувствительность. А стронций а) бесцветный, б) Комплексы если и образует, то крайне непрочные. Кроме кобальта еще используют соли Никеля. |
plotter Постоянный участник Стыдно признаваться о том, где живу... |
|
Крыска Участник |
Можно ли при использовании ПВДФ мембраны пользоваться трансфер буффером на Этаноле или в этом случае только метанол??? |
smmuscle Участник |
|
Крыска Участник |
|
smmuscle Участник |
|
svetodiodovna |
|
guest: ммм IP-штамп: frPZdWSNeN.0k гость |
1.Как вы это установили? 2. Какова масса белка? И процентность геля? -что добавить в буфер для переноса или в sample buff Может быть вам мембрану с другой стороны положить? Добавьте 0.02% SDS в буфер для переноса. Но боюсь что причина не в том что он не переносится? |
protein Постоянный участник Magyarország |
|
svetodiodovna |
Мембрану после переноса крашу ponceau red, моего белка нет, все остальное прокрашивается. Акриламидный гель после переноса крашу кумасси, мой белок четко виден, остальные не прокрашиваются (отрицательный контроль, маркеры) Масса белка 22кДа, процентность акриламидного геля - 12%. В буфер для переноса пробовала добавлять SDS до концентрации 0,2%. Не помогло. Хочу попробовать положить мембрану с двух сторон, тогда мой белок и маркеры с отрицательным контролем будут на разных мембранах. |
smmuscle Участник |
|
smmuscle Участник |
Сообщение было отредактировано smmuscle - 15.02.2010 15:35 |
guest: ммм IP-штамп: frKx.BJzj62lY гость |
Это ничего не значит, у понсо очень низкая чувствительность, раз в 10 меньше чем у кумаси. Те может оказаться что то что видит кумаси, понсо просто не видит. -Масса белка 22кДа, процентность акриламидного геля - 12%. Должен вылетать на раз. -В буфер для переноса пробовала добавлять SDS до концентрации 0,2%. Не помогло. Так много SDS не имеет смысла(даже плохо) у вас белки начнут пролетать мимо мембраны в такой процентности SDS. Не надо грузить SDS больше 0.05%. Если хотите для маленького белка(22кДа) добавьте спирта до 20% будет получше. 1) Покрасьте белок антителами на мембране или кумасей(если вам не жалко блота, от кумаси потом практически не отмыться.) Просто что бы убедится, что все так плохо как вы думаете. Я думаю иначе. 2) Добавте этанола в буфер и немного SDS и увеличьте ток или время переноса. Результаты должны улучшиться. |
svetodiodovna |
(smmuscle @ 15.02.2010 16:35) а вообще, странно , если при электрофорезе он входит в гель, то почему же он не переносится тогда. Или у Вас форез какой-то экзотческий, не по Лэммли? Форез стандартный, если не ошибаюсь верхний и нижний гели содержат по 0,1%SDS, а running buffer - 0,4% SDS. Видимо, такого количества SDS хватает, чтобы белок приобрел отрицательный заряд и двигался в геле. Поэтому, в буфер для переноса я добавила SDS 0,2% (встречала в инете от 0,01 до 0,1%. Я добавила больше, чтобы наверняка, но как-то не помогло) |
svetodiodovna |
(guest: ммм @ 15.02.2010 18:11) -Мембрану после переноса крашу ponceau red, моего белка нет. Это ничего не значит, у понсо очень низкая чувствительность, раз в 10 меньше чем у кумаси. Те может оказаться что то что видит кумаси, понсо просто не видит. Мембрану красила амидовым черным, вроде, достаточно чувствительный краситель. (guest: ммм @ 15.02.2010 18:11) Так много SDS не имеет смысла(даже плохо) у вас белки начнут пролетать мимо мембраны в такой процентности SDS. Не надо грузить SDS больше 0.05%. Если хотите для маленького белка(22кДа) добавьте спирта до 20% будет получше. Спасибо. Попробую такой вариант тоже. (guest: ммм @ 15.02.2010 18:11) 1) Покрасьте белок антителами на мембране или кумасей(если вам не жалко блота, от кумаси потом практически не отмыться.) Просто что бы убедится, что все так плохо как вы думаете. Я думаю иначе. Мембрану антителами проявляла. ECL работает точно. |
svetodiodovna |
(guest: ммм @ 15.02.2010 18:11) Гнала при 30мА ночь при +4 и 250-300мА в течение 2 часов. Этого достаточно или еще увеличить силу тока? |
Daemonarchestratygos Постоянный участник |
(svetodiodovna) У меня сильно положительный белок (pI=11,25) и он совсем не хочет переноситься на PVDF мембрану. Масса белка 22кДа, процентность акриламидного геля - 12%. 1) Есть такие маленькие (10-22 кДа), сильно оснОвные (pI 10.5-11) ядерные белки - гистоны. И с ними такой проблемы почему-то не возникает. 2) А чем нитроцеллюлоза хуже ПВДФ? Сообщение было отредактировано Daemonarchestratygos - 15.02.2010 22:35 |
svetodiodovna |
(Daemonarchestratygos @ 15.02.2010 23:30) По-моему, эти мембраны ничем принципиальным не отличаются (или я ошибаюсь?) Поэтому я работала над белком: подщелочила его до рН9 (вместо 4,5 в буфере Е), sample buf использовала с 9М мочевиной, добавила еще больше сдс в sample buf, кипятила,добавила сдс в буфер для переноса. Всеми этими манипуляциями я пыталась сдвинуть заряд белка в более отрицательную сторону и поспособствовать переносу. Но если вы считаете, что нитроцеллюлоза поможет, я попробую. Мне в принципе интересно, как работают с положительными белками? Я думала, что есть модификации классических методик. Или никаких особых манипуляций над ними не производят,а хватает обычного содержания сдс для придания отрицательного заряда? Видимо, буду пробовать разные варианты, которые были предложены выше, и постараюсь победить этот белок упорством. |
smmuscle Участник |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Как то странно вы отвечаете белок-то ваш покрасился или нет. Работоспособность ЕСL можно проверить вообще без блота. -Гнала при 30мА ночь при +4 и 250-300мА в течение 2 часов. Этого достаточно или еще увеличить силу тока? 1) Совершенно бессмысленно это обсуждать без указания других параметров переноса 2) К тому же если сказано увеличить, то надо увеличивать просто, что бы проверить как это скажется на результате. Не существует никакой теории, которая предсказывает результат переноса по его параметрам. Существуют только эмпирические рекомендации. А антитела то у вас работают вы не пробовали просто дот красить. - подщелочила его до рН9 (вместо 4,5 в буфере Е) Это еще что такое кислые буфера кодировки буквенные, непонятно, -sample buf использовала с 9М мочевиной, добавила еще больше сдс в sample buf Странно, у вас что белок сильно в осадке, мембранный? Зачем мочевина в сэмпле? Щелочной белок с pI больше 9 в 9М мочевине, не зависимо от количества SDS в пробе, рискует вообще вылететь из геля. Непонятно как он у вас в гель входит, может это и не он вовсе. |
PerkinElmer Moscow |
Компания “Pribori Oy” предлагает большой выбор реагентов для проведения western blotting analysis (вестерн-блотинг анализа) производства американской фирмы “Perkin Elmer” для научных исследований, медицины и биотехнологии. Поставка продукции выполняется точно в срок со склада и под заказ. Высокое качество при умеренной цене! С уважением, компания "Pribori Oy" |
biooil |
|
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
Не должОн. |
biooil |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
DK. Постоянный участник |
Сейчас опять возникла необходимость в блоттинге для другой задачи - но за это время появилось множество фирм, поставляющих готовые полиакриламидные гели для белкового SDS-фореза, да и с ECL реагентами большой выбор . Памятуя, что но "умный учится на чужих ошибках, а дурак на своих" , решил спросить вас - наверняка здесь многое перепробовано -из вашего опыта, готовые гели каких производителей наиболее достойны внимания по соотношению цена/качество?( это прежде всего экономия времени - или они еще и, действительно, лучше самодельных?) Тот же вопрос по ECL: цена/чувствительность, поскольку искомые белки ( в диапозоне 25-50 кДа), предположительно, слабо экспрессированы. Что посоветуете? - заказываться будет в Европе. |
Tom1 Постоянный участник |
Что касаемо ЕСЛ то пользую 2 один " домашний" по прописи аналогичной выложенной тут в разделе методы люминол-кумариковая кислота и "фемто" от "Шивера" на случай совсем уж слабенького сигнала. Все енто касаемо реактивов в юсах, в европах чесно скажу не ведам гы-гы)))
|
DK. Постоянный участник |
(Tom1 @ 03.07.2011 02:38) Все енто касаемо реактивов в юсах, в европах чесно скажу не ведам гы-гы))) - они все и по европам распластались уже .
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |