Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Forum robot Постоянный участник на сервере в Москве |
|
Гость IP-штамп: fra6xdMWXgbHc гость |
|
А Постоянный участник Россия |
|
Tecan Участник |
|
Shusha СПб - Magdeburg |
|
Гость IP-штамп: frDQwa9k7riYg гость |
|
Elshad |
|
Werta Участник Москва |
А как было правильно замечено выше - надо гнать разные белки при разном pH |
Samuray Suomi |
Я как-то пытался определить димеризуется или олигомеризуестя мой рецептор при активации ростовым фактором, приходилось как раз использовать тотальные лизаты и нативный форез. Картинка была страшная, и выходило, что мой рецептор в клетках тетрамеризовался. При добавлении в гель следовых количеств саркозила окрашивание антителами показало присутствие только димера. Позже мы показали что это действительно так - обычный димер. Думаю, что и мизерные кол-ва SDS будут также работать. Хотя нкто не даст грантии, что если есть димер то нет более высокой олигомеризации.... |
antiximik Постоянный участник |
Лично я подбирал условия для нативного фореза (концентрация "геля", сила тока, рН буфера для разделяющего геля и рН электродного буфера), причем НИГДЕ не присутствовали даже следовые количества ДДС, а пробы подготавливали простым смешением анализируемого раствора с бромфеноловым синим с добавлением глицерина. При этом удавалось "пронаблюдать" наличие тетрамеров, додекамеров, икосамеров... :) З.Ы. К минусам стоит отнести то, что "загружать" белка приходится больше, чем для "обычного" денатурирующего фореза... Дерзайте... |
Kas London,UK |
|
Kas London,UK |
|
ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
real-sugar |
|
Гость IP-штамп: frtbMasbqESIo гость |
|
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
Krosha Участник Москва |
|
Guest IP-штамп: frtbMasbqESIo гость |
|
Krosha Участник Москва |
Возможно, дадут подробную методику. 1. Вырастить вирус в курином эмбрионе или на культуре клеток 2. Инактивировать формальдегидом 3. Детергент Триметил-Цетил-Аммониум Бромид (TCAD) позволяет выделять гемагглютинин и нейраминидазу в самостоятельные субъединицы. 4. Поверхностные белки выделяются с помощью очередного ультрацентрифугирования. Белки очищаются от детергента и внутренних составляющих вирусной частицы при помощи диализа. Активность выделенного белка зависит от штамма. Некоторые вообще не растут на яйцах, а только на клетках и тд. Там нюансов много. Идентифицировать ГА Вы можете в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) А чью сыворотку Вы собираетесь получать, если не секрет? Протокол иммунизации у Вас есть? Метод РТГА умеете ставить? Условия, чтоб с живым вирусом работать? |
SASh IP-штамп: frDQwa9k7riYg гость |
|
Krosha Участник Москва |
В УФЕ этим занимается Микроген. Но будут ли они кому помогать - вопрос. |
Krosha Участник Москва |
Пишите мне в личку. |
Гость IP-штамп: frWKf2AKRVu2Q гость |
|
guest: ммм IP-штамп: fr.ReEIhc9B8A гость |
Дык! это! Пихаете куски геля с вырезанной зоны в диализный пакетик и подвергаете электрофорезу в трис глициновом или трис боратном буфере. Потом извлекаете раствор из мешочка и концентрируете на микроконе или центриконе от милипора. Это один из вариантов. |
avor moderator |
|
Tivan |
|
Tom1 Постоянный участник |
(Tivan @ 31.03.2011 08:54) Помогите, пожалуйста, как провести нативный форез смеси ИгГ ИгМ ИгА. Пробовала в 4% нативном ПААг - смесь не входит в гель. Хочу попробовать агарозный гель. Подскажите, какой нужно использовать буфер для фореза? 2-D native-PAGE/SDS-PAGE visualization of an oligomer’s subunits: Application to the analysis of IgG Leticia Gonzalez et. at. Electrophoresis 2006, 27, 2016–2023 © 2006 2.2.1 First-dimensional native PAGE IgG oligomers in sample buffer (60 mM potassium hydroxide, 63 mM glacial acetic acid, 25% v/v glycerol, pH 4) were electrophoresed in a 1 mm thick first-dimensional discontinuous native polyacrylamide slab gel (4% T, 2.1% CBIS stacking gel, pH 4; 6% T, 2.1% CBIS running gel) under acidic conditions (pH 4) according to Reisfeld et al. [3] in a BioRad Mini-Protean II cell. The aqueous anode buffer contained potassium hydroxide (48.5 mM) and glacial acetic acid (4.3% v/v). The aqueous cathode buffer contained b-alanine (350 mM) and glacial acetic acid (0.8% v/v). Proteins were electrophoresed at constant voltage (200 V) until the tracking dye (dimethyl green) reached the bottom of the gel. 2.2.2 Staining of native polyacrylamide gels Separated proteins were visualized by staining polyacrylamide gels by either the native fast silver method of Shevchenko et al. [4], the permanganate silver stain tion for 26 h at room temperature in the dark, and then visualizing using a Chromato-Vac Transilluminator Model TM 10 with a wavelength of 302 nm. Table 1 provides a summary of the fixing and staining protocols. извиняюсь что стайку не привожу полностью. Модеры не дают пдф файл прикреплять гы-гы))) |
plotter Постоянный участник Стыдно признаваться о том, где живу... |
извиняюсь что стайку не привожу полностью. Лучше так. Статейка через две недели того. А в такой форме будет долго лежать. |
Guest IP-штамп: frNgDO7rvIshI гость |
|
Guest IP-штамп: frNgDO7rvIshI гость |
|
Aleg |
Белочек то щелочной, может дело в рН буферов? |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Однозначно, кто ж щелочные белки в щелочных буферах, гоняет обратная полярность здесь не поможет. |
ERiNaCeUS Участник Москва |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Лучше рибофлавин и свет, если есть возможность. Много темеда портит картинку в геле. |
Aleg |
|
ERiNaCeUS Участник Москва |
|
Daemonarchestratygos Постоянный участник |
(guest: ммм @ 27.04.2011 13:07) -- ТЕМЕDа надо раз в пять больше - полимеризация идет хуже при низком рН Лучше рибофлавин и свет, если есть возможность. Много темеда портит картинку в геле. Во-во, к тому же 1% витамин В2 в любой аптеке продаётся и стоит копейки. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |