Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Лигирование -- comments to a permanent page of the site --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Тема связана с: Лигирование
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 28.05.2014 17:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

С чем может быть связаны проблемы с клонированием? вставка/вектор~5, рестрикты проверены на форезе после очистки китом, на x-gal вырастают белые и синие колонии, но белые на ПЦР всё равно не дают вставки. Специфичность праймеров проверена на лигир. смеси и хромосоме MG. Можно уже утверждать, что проблема не в реагентах, а в технике выполнения. Но всё-таки, если кто-то сталкивался неописанными проблемами, поделитесь своим опытом выхода из ситуации?
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.05.2014 10:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

размер вставки?
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 29.05.2014 15:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

как правило, это связано с тем, что слишком мало нуклеотидов добавлено в праймерах по концам
Участник оффлайн! Epsilon

Новосибирск



 прочитанное сообщение 29.05.2014 17:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Тут два варианта:
- либо Ваша встройка не лигируется в Ваш вектор (несовместимые концы из-за непрошедшей рестрикции, как Вам говорили, либо проблемы с фосфорилированием 5' концов...),
- либо встройка выкидывается из вектора после лигирования при репликации плазмиды. Разновидность этого варианта: негативная селекция против плазмид, содержащих встройку.

Если Вы делали ПЦР с лигазной смеси и видели продукт, соответствующий лигированной плазмиде, то вероятнее второе объяснение. Опять же, белые колонии могут означать, что рамка гена LacZ всё же сдвинута остатками неудалённой встройки...

Нам в подобных случаях помогало изменение ориентации встройки на противоположную, либо использование специального вектора без селективного гена и с терминаторами транскрипции по краям от полилинкера.

Вы не секвенировали встройки в плазмидах из белых колоний?
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 29.05.2014 18:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(R.J.Dio @ 29.05.2014 11:02)
Ссылка на исходное сообщение  размер вставки?

размер гена ~1400 bp
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 29.05.2014 18:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(Epsilon @ 29.05.2014 18:58)
Ссылка на исходное сообщение  Тут два варианта:
- либо Ваша встройка не лигируется в Ваш вектор (несовместимые концы из-за непрошедшей рестрикции, как Вам говорили, либо проблемы с фосфорилированием 5' концов...),
- либо встройка выкидывается из вектора после лигирования при репликации плазмиды. Разновидность этого варианта: негативная селекция против плазмид, содержащих встройку.

Если Вы делали ПЦР с лигазной смеси и видели продукт, соответствующий лигированной плазмиде, то вероятнее второе объяснение. Опять же, белые колонии могут означать, что рамка гена LacZ всё же сдвинута остатками неудалённой встройки...

Нам в подобных случаях помогало изменение ориентации встройки на противоположную, либо использование специального вектора без селективного гена и с терминаторами транскрипции по краям от полилинкера.

Вы не секвенировали встройки в плазмидах из белых колоний?


нет, не секвенировали. Насчёт изменения ориентации- делал лигазные смеси по sticky и blunt - на обоих ПЦР показал наличие встройки (правда, только перекрёстными праймерами, фланкирующие показывают отсутствие, хотя это может говорить, только о том, что плазмиды со встройкой просто очень мало почему-то). А почему при репликации может выкидываться встройка?
Участник оффлайн! Epsilon

Новосибирск



 прочитанное сообщение 29.05.2014 19:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Интересно... То есть отсутствие встройки в плазмидах из белых колоний Вы смотрели по длине рестрикционных фрагментов?

А ПЦР показывает лигирование по обоим сайтам? Вообще, вариантов, при которых у Вас не прошло лигирование, гораздо больше, чем вариантов полного и бесследного удаления встройки в результате её нестабильности. Если можно, опишите подробнее последовательность Ваших действий (ПЦР, рестрикиция, CIAP дефосфорилирование, T4 PNK фосфорилирование, лигирование...). Что конкретно Вы делали?

---

К сожалению, причины нестабильности встроек мне известны плохо. Просто я много раз сталкивался с тем, что при клонировании по тупым, либо А/Т концам наблюдается существенная асимметрия направления встройки в клонах, что говорит о селекции против плазмид с одной из ориентаций. Также сталкивался с отсутствием клонов при попытке клонировать встройку в заданной ориентации по разным липким концам.

Вероятно, некоторый вклад в возможную нестабильность вносит транскрипция и трансляция встройки, которая имеет место в векторах с репортёрным геном типа серии pUC.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 30.05.2014 09:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

ваше описание проблемы, действительно, страдает огорчительной неполнотой данных. Опишите все по порядку: вектор, по каким сайтам делался, вставка, какие сайты. если резался ПЦР, то как Вы контролировали полноту рестрикции фрагмента, сколько букв на концах праймеров, если все же был ПЦР. были ли выставлены контроли- нерезанная плазмида, резанная по одной из рестриктаз, все это желательно предоставить в наглядном виде, со слов не принимается. иначе делу не поможешь. А мистику типа рекомбинации оставьте для полоскания мозха студентам, они учебники читают, там такое есть, а в практике редко. Да, и еще- анализ рекомбинантов следует делать ПЦр с колоний стандартными праймерами М13, коли у вас есть бело-голубая селекция, и не придумывать велосипед. ПЦРить лигазную смесь не только бессмысленно, но и вредно, результаты ни о чем не говорят, просто руки занять. ВЫ же по результатам такого ПЦР в любом случае не откажитесь ставить трансформацию с последующим анализом, тогда зачем время и реактивы тратить- чтоб шеф видел, что вы не в Фэйсбуке сидите?
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 30.05.2014 10:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Хорошо. описываю подробно эксперимент. Вектор pMW118, разрезался EcoRI/BamHI (ночьб 2XTango), форез соответствует рестрикту (но сначала делал разрезы по очереди и смотрел на форезе, рестрикция по каждой из этих рестриктаз идёт). Вставка -ПЦРный ген со встроенными по краям сайтами EcoRI и BamHI, по 4 nt от места разреза. проверка вставки была и праймерами M13 (полосы соответствуют контролю, но у образцов слегка прыгают), и перекрестными (М13+праймеры на сам ген), которые на лигазной смеси и показали наличие вставки (лигазную смесь не в первый раз пцрил, но если не видел намёка на вставку, не трансформировал). Дефосфорилирование тоже не помогло - отбирал плазмиды без вставки, но белые на x-gal. Раз не получалось по липким, попробовал по тупым, плазмиду порезал по SmaI и с PEG залигировал с геном. И опять по M13 полосы на уровне контроля, а с перекрестными намёк на вставку. Опять же отбирал на x-gal белые колонии.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 30.05.2014 11:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

похоже на то, что в одном из праймеров реально нет сайта рестриктазы (какой-то). Это раз. Далее, надо проверить лигазу- возможно, то что вырастает, это всякого рода недорез вектора (только не надо говорить, что тогда колонии будут голубыми- ночь с ферментасом - не каждый конец переживет, не пользуйтесь ни Ф., ни ночными развлечениями, нормальная рестриктаза NEB делает все за макс. 1,5 часа). Ну и опять же, рестриктазы поменяйте и не более 2-ух часов. Это первой, что приходит на ум
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 30.05.2014 17:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Eco-BamHi режу в Бамовском буфере (кстати в нем режут очень многие ферментасовские рестриктазы), достаточно 2 ч, на ночь не стоит.
и я что-то не понял, вы вставку только по ПЦР смотрите? по Eco-Bam ничего не вырезается?
и опять таки описание не полное. как вектор чистили после рестрикции? как чистили вставку?
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 30.05.2014 18:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

вставка у него вроде ПЦРом генерится, сайты на концах, как смотреть рестрикцию, длина неизменна. Про почистку вектора я даже не спросил, вроде гель сам собой разумеется...Хотя...Блин, все бывает, действительно. И вставка тоже, если ПЦР с плазмиды, оно и растет, если без геля и антибиотик не меняется. Вариант. Но это ж ни в ..., ни в Красную Армию. Надеюсь, что все не так
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 02.06.2014 14:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(ship @ 30.05.2014 18:29)
Ссылка на исходное сообщение  Eco-BamHi режу в Бамовском буфере (кстати в нем режут очень многие ферментасовские рестриктазы), достаточно 2 ч, на ночь не стоит.
и я что-то не понял, вы вставку только по ПЦР смотрите? по Eco-Bam ничего не вырезается?
и опять таки  описание не полное. как вектор чистили после рестрикции? как чистили вставку?


Вставку смотрел только по пцр. Поскольку плазмида малокопийная, чтобы увидеть разваливается ли она на две части, это ж надо нарастить много культуры, потом выделить плазмиду - процесс долгий, но я к нему уже подхожу) Для начала вобью её в штамм-ауксотроф по своему гену и там посмотрю по пцр. Возможно, правда, своей долгой рестрикцией я как-то подпортил концы вставки или вектора, хотя эти рестриктазы не значатся звёздными в 2ХTango. Вектор и вставку после рестрикций чистил китом ферментосовским с селикагелем вроде.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.06.2014 15:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

то есть без геля? Ну и все, вот вам ответы на все вопросы. Это у вас растет недорез вектора (он есть всегда, не , не так, ВСЕГДА! вне зависимости, видите ли вы его глазками или нет. Только гель! Потому как 100 ретрикций не бывает, есть формы плазмиды, которые не режутся и режутся намного медленнее, конкатамеры всякие, подплавленные одноцепочечные участки, бог ведает что. вам 0,1 % недреза хватит за глаза, прикиньте сами- скажем, 0,1%- это 0,1 нг минимум. С 1 мкг растет 10 в 7. Ну ладно, 10 в 6. Сколько будет фона? Правильно, 10 в 3. Тыща штук. И никогда ничего не заклонируете. Мало плазмиды для вырезания- мужайтесь, копите материю и...режьте из геля

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): ship
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 02.06.2014 16:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

ну вот, я же говорил)) ну нарастите 1л среды и выделите оттуда плазмиду, классическим протоколом с фенолом, будет максимальный выход.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): R.J.Dio
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 02.06.2014 17:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

Мальчеги, пардон май френч, вы круче я знаю, а на фига гель для вектора? чем он поможет? Вставку надо после писиара чистить, ибо там мелочь пузатая может лигироваться...


берешь гамму плазмиды, режешь ее обоими ферментами (20 ю) 2 часа в 100 мкл, вставку также, концентрация 5-10 раз выше, чистишь колонками. Смешиваешь 1 к 5 и шьешь полчаса на столе. Эффективность процедуры, если фрагменты не очень длинные, 50-95% . Уже много лет как и много раз.

Для маленьких добавлю, все хорошо перемешивать и перед инкубациями откручивать.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 02.06.2014 18:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

ага, еще научи как руки мыть после туалета, умник
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 02.06.2014 21:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(Esya @ 02.06.2014 15:06)
Ссылка на исходное сообщение  
берешь гамму плазмиды, режешь ее обоими ферментами (20 ю) 2 часа в 100 мкл,  вставку также, концентрация 5-10 раз выше, чистишь колонками. Смешиваешь 1 к 5 и шьешь полчаса на столе. Эффективность процедуры, если фрагменты не очень длинные, 50-95% . Уже много лет как и много раз.

спасибо, посмеялся
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 02.06.2014 21:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

в том то и фишка, кому процесс, а кому результат smile.gif я и обезьяну могу клонировать научить, а вы одному студиозу мозги неделю парите smile.gif
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 02.06.2014 22:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

ну вам в голову не приходит, что при приготовлении вектора из него может вырезаться фрагмент??? и что вы на колонке очистите в этом случае?? плюс недорез, который есть всегда как, сказано выше.
то что вы советуете - это моветон, то как не надо делать.
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 02.06.2014 22:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

а вам в голову не приходит, что вставки дается избыток и она, как правило, длиннее, а, значит, вшивается значительно лучше, и что короткие куски с колонкой связываются намного хуже, а меньше 40, вообще, не связываются ?

знаю я таких пуристов, им все моветон, на банальное клонирование им нужно неделя рабочего времени

мне, когда я клонирую, уже ничего в голову не приходит за ненадобностью, в 1001 раз об этом не думают - последний этап думания, когда олиги делаю
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 02.06.2014 22:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

а, вот, недореза, кстати, быть не должно
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 02.06.2014 22:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(Esya @ 02.06.2014 20:16)
Ссылка на исходное сообщение  а вам в голову не приходит, что вставки дается избыток и она, как правило, длиннее, а, значит, вшивается значительно лучше

вставка длинее чего??? мне не приходит в голову. у меня есть опыт, который показывает, что все далеко не так как в книжках и мануалах.

у меня ощущение, что вы плазмиды вообще в руках не держали, если уверены в том, что недореза не бывает.

и да, неделя уйдет у вас, когда будете разгр*** все то дерьмо, которое вырастет при вашем "способе" клонирования.
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 02.06.2014 23:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

все это было бы смешно, если бы такие учителя тут не учили...
ей богу, мои тапочки уже икают
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 03.06.2014 11:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(R.J.Dio @ 02.06.2014 16:44)
Ссылка на исходное сообщение  то есть без геля? Ну и все, вот вам ответы на все вопросы. Это у вас растет недорез вектора (он есть всегда, не , не так, ВСЕГДА! вне зависимости, видите ли вы его глазками или нет. Только гель! Потому как 100 ретрикций не бывает, есть формы плазмиды, которые не режутся и режутся намного медленнее, конкатамеры всякие, подплавленные одноцепочечные участки, бог ведает что. вам 0,1 % недреза хватит за глаза, прикиньте сами- скажем, 0,1%- это 0,1 нг минимум. С 1 мкг растет 10 в 7. Ну ладно, 10 в 6. Сколько будет фона? Правильно, 10 в 3. Тыща штук. И никогда ничего не заклонируете. Мало плазмиды для вырезания- мужайтесь, копите материю и...режьте из геля


Я уже писал, что отбираю клоны на X-gal. Действительно много голубых ,но есть и белые, в которых и моя проблема)
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 03.06.2014 11:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(Esya @ 02.06.2014 18:06)
Ссылка на исходное сообщение  Мальчеги, пардон май френч, вы круче я знаю, а на фига гель для вектора? чем он поможет? Вставку надо после писиара чистить, ибо там мелочь пузатая может лигироваться...
берешь гамму плазмиды, режешь ее обоими ферментами (20 ю) 2 часа в 100 мкл,  вставку также, концентрация 5-10 раз выше, чистишь колонками. Смешиваешь 1 к 5 и шьешь полчаса на столе. Эффективность процедуры, если фрагменты не очень длинные, 50-95% . Уже много лет как и много раз.

Для маленьких добавлю, все хорошо перемешивать и перед инкубациями откручивать.


Всё написанное вами было уже обговорено раннее. Всё делалось так, как и у вас - поэтому у меня и возник вопрос, какие могут быть проблемы в такой простой технике. Ничего нового не написали.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.06.2014 11:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

спор бессмыслен. у чела не выходит, а вы по сути предлагаете ему ничего не менять, делать как делал. Тогда к чему советы. Недорез есть всегда, это аксиома, просто у вас, далекий американский друг, несколько иные отправные условия- если плазмида чистится на ките, плазмида многокопийная (соотв, и примесей мало при выделении), если берутся суперсвежие ферменты не по единицам, а по микролитрам), то в принципе, можно себе позволить халяву. Подчеркну еще раз- то, что вы советуете, ни коим образом не может быть руководсвом к действию в общем случае. Пример простой- никогда в автошколе вам не скажут- садитесь так, чтоб можно было рулить коленом, а руки свободные держите, одна- для сигареты, а другая- для сотового, всегда почему-то все начинают на "без десяти два"
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.06.2014 11:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

если у студиозуса не получается, а новой инфо якобы он не снял, то вариантов тут много можно предложить, а именно :
а) забить на все и всех козлов с советам и продолжать в гордыне
б) просто забить и не продолжать
в) продумать весь ход работы без гонора и найти ошибку в свете всего вышесказанного
ибо она-таки есть, иначе бы все получилось
г) окропить стол святой водой и повторить клонирование
стати, не уточнялось, фрагмент получен ПЦРом с чего- если с плазмиды с той же устойчивостью, что и целевой вектор, то еще один пойнт- фрагмент также надо чистить на геле (не буду объяснять почему, должно быть понятно)

Сообщение было отредактировано R.J.Dio - 03.06.2014 11:24
Участник оффлайн! Alex2006
Постоянный участник
Берлин



 прочитанное сообщение 03.06.2014 14:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

Лучше всё резать из геля.

velekap, а сколько белых колоний Вы проверили? может просто мало?

если есть праймеры в векторе и вставке, проверьте колоний 40 через "colony pcr" - и наткнетесь на свою вставку. Быстро и эффективно.
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 03.06.2014 15:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

даже с нашими суперсвежими ферментами (вчера пользовалась 05.2007, есть и 2002) на концах праймера у меня 9 экстра нуклеотидов

поэтому, у меня все всегда режется, и у тех, кого я научила тоже, в том числе и в россии (белок из последней российской статьи был проклонирован за 2 дня довольно кривыми руками с использованием мерзкой NdeI)

- всегда и шьется

- и да, экономить это старье ине не приходится, не знаю, когда само кончится, добавляю по микролитрам

повторюсь, проблема не с недорезом вектора, а с недорезом вставки, а недорез вставки из-за - см. выше

Сообщение было отредактировано Esya - 03.06.2014 15:24
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.06.2014 15:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

самоуверенность мадам- от тлетворного влияния западного феминизма, тут клиника, тут все понятно. Ща не об том.
4 буквы хватает всегда, и Nde я нежно люблю, хоть и ругают его за 2 буквы, которые якобы лигируются хуже, чем тупо, что есть бред, конечно. Изя пусть отдохнет и не полощет мозх молодежи
А фраза - проклонировано за 2 дня- ну, во-первых, мы не тараканьих бегах, где 2, там и три, тут точно не принципиально, и потом, 2 дня - это без сиквенса, а без сиквенса клонирование не считается. Так можно посчитать, что вовсе за 2 часа все сделано- типа, порезал- значит, заклонировал, Глупота. Короче, чято там с гелем? А ну так вот- резать надо, а Изя отдохнет

Сообщение было отредактировано R.J.Dio - 03.06.2014 15:36
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 03.06.2014 15:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(Alex2006 @ 03.06.2014 15:02)
Ссылка на исходное сообщение  Лучше всё резать из геля.

velekap, а сколько белых колоний Вы проверили? может просто мало?

если есть праймеры в векторе и вставке, проверьте колоний  40 через "colony pcr" - и наткнетесь на свою вставку. Быстро и эффективно.


Проверил 8 и 4 колоний (2 Тф) - праймерами М13 и перекрестом М13-праймеры на ген. Выяснилось, что с клеток пцр лучше не делать-отжигаются где-то на хромосоме. Пока выделил две плазмиды и их проанализировал. Пока не те.
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 03.06.2014 15:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(R.J.Dio @ 03.06.2014 12:24)
Ссылка на исходное сообщение  если у студиозуса не получается, а новой инфо якобы  он не снял, то вариантов тут много можно предложить, а именно :
а) забить на все и всех козлов с советам и продолжать  в гордыне
б) просто забить и не продолжать
в) продумать весь ход работы без гонора и найти ошибку в свете всего вышесказанного
ибо она-таки есть, иначе бы все получилось
г) окропить стол святой водой и повторить клонирование
стати, не уточнялось, фрагмент получен ПЦРом с чего- если с плазмиды с той же устойчивостью, что и целевой вектор, то еще один пойнт- фрагмент также надо чистить на геле (не буду объяснять почему, должно быть понятно)

ну да, мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск, а потом с новыми силами попытаться опять клонировать)
В общем, перезаказал праймеры на вставку, делаю рестрикцию максимум 4 часа, а не ночь, рестрикты чищу не китом. а переосаждаю (после кита почему-то бывали большие потери), концентрации смотрю по форезу и NanoDrop. К концу недели поделюсь результатами.
Да, и не студент я)Просто в молбиоле всего чуть больше года и клонирование никогда не делал.
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 03.06.2014 16:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ

R.J.Dio - моя самоуверенность только от опыта, я совершенно спокойно прихожу спрашивать на молбиол и мне помогают - а вы как хотите, мне важнее, что мне не придется траблшутить и я все стандартное делаю с запасом прочности


"после кита почему-то бывали большие потери" - спирт в промывочном буфере испарился\выпили


" мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск" lol.gif представила американского шефа с таким предложением, скорее, он предложил бы отдохнуть на пособии по безратотице
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.06.2014 16:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

R.J.Dio - моя самоуверенность только от опыта, я совершенно спокойно прихожу спрашивать на молбиол и мне помогают - а вы как хотите, мне важнее, что мне не придется траблшутить и я все стандартное делаю с запасом прочности


я? Я не хочу. ни доказывать, что 2х2=4, ничего. У меня-то проблем с клонированием и скоростью ея нету, а имеющий уши да услышит. Воспользуется чел советами- нет, его дело, инфу получил, пусть думает
А вы как-то ловко перевели разговор на себя, у вас нету пробем, и еще там чего-то нету (или есть?) , причем тут вы, человек пришел со своим вопросом, а вы все про себя и про себя. точно- америка портит женщин

Сообщение было отредактировано R.J.Dio - 03.06.2014 16:28
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.06.2014 16:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(velekap @ 03.06.2014 16:48)
Ссылка на исходное сообщение  ну да, мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск, а потом с новыми силами попытаться опять клонировать)
В общем, перезаказал праймеры на вставку, делаю рестрикцию максимум 4 часа, а не ночь, рестрикты чищу не китом. а переосаждаю (после кита почему-то бывали большие потери), концентрации смотрю по форезу и NanoDrop. К концу недели поделюсь результатами.
Да, и не студент я)Просто в молбиоле всего чуть больше года и клонирование никогда не делал.

ну не студент, ок, но начинающий клонировальщик. Это сути не меняет. Попробуйте так и сяк, где получится, там и правильно.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.06.2014 16:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(velekap @ 03.06.2014 16:42)
Ссылка на исходное сообщение  Проверил 8 и 4 колоний (2 Тф) - праймерами М13 и перекрестом М13-праймеры на ген. Выяснилось, что с клеток пцр лучше не делать-отжигаются где-то на хромосоме. Пока выделил две плазмиды и их проанализировал. Пока не те.

как это М13 отжигаются на хромосоме? Это у вас фоны идут с клеток, грязь, реально пустышка и ПЦР нет. Хотя странно, а почему ж тогда нету короткого ПЦР (фрагмент между двумя М13, полилинкер там и прочая). Что-то у вас в системе напрочь сбоит
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 03.06.2014 16:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(R.J.Dio @ 03.06.2014 17:30)
Ссылка на исходное сообщение  как это М13 отжигаются на хромосоме? Это у вас фоны идут с клеток, грязь, реально пустышка и ПЦР нет. Хотя странно, а почему ж тогда нету короткого ПЦР (фрагмент между двумя М13, полилинкер там и прочая). Что-то у вас в системе напрочь сбоит

Чисто с М13 я вижу минимальный фрагмент, вот М13 с праймерами на ген дают неспецифику в пцр с клеток.
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 03.06.2014 16:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(Esya @ 03.06.2014 17:12)
Ссылка на исходное сообщение  R.J.Dio  - моя самоуверенность только от опыта, я совершенно спокойно прихожу спрашивать на молбиол и мне помогают - а вы как хотите, мне важнее, что мне не придется траблшутить и я все стандартное делаю с запасом прочности
"после кита почему-то бывали большие потери" - спирт в промывочном буфере испарился\выпили


" мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск" lol.gif представила американского шефа с таким предложением, скорее, он предложил бы отдохнуть на пособии по безратотице


ну с юмором у американцев всё понятно) Тем более, что кроме клонирования достаточно работы, а неудача с ним просто стопорить интересный эксперимент.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.06.2014 17:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

аминь
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 03.06.2014 17:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

я б так сделал:
может и на пару дней дольше, но результат гарантирован. вам же не 100 плазмид делать.

1. Берете кит для клонирования тупых продуктов ПЦР (выже наверняка ПЦРите пруфридинг полимеразой?).
2. Клонируете туда свой ПЦР ппродукт.
3. Режете по тем сайтам, что у вас в праймерах, убеждаетесь, что они на месте и вырезается нужная вставка. (не пойму тока почему вам нравится скринировать на вставку ПЦРом, а не рестрикцией)
4. Вырезаете вставку из вектора, чистите из геля.
5. Режете целевой вектор, чистите его из геля.
6. Ставите лигирование и скорее всего через пару дней прыгаете от радости.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.06.2014 18:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

да хоть ТА-вектор, ничего, что пруф-ридинг полимераза, буквы все равно висят (25% по литературе)- так что можно не париться и клонировать куда придется. А так- да, только я б сначала отсеквенил, где ПЦР- там сиквенс, правило хорошего тона, а потом- как написано, перекинуть вставку
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 03.06.2014 19:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(R.J.Dio @ 03.06.2014 16:23)
Ссылка на исходное сообщение   А так- да, только я б сначала отсеквенил, где ПЦР- там сиквенс, правило хорошего тона, а потом- как написано, перекинуть вставку
ну я и имел это ввиду, тока сначала порезать просто, чтобы понять, что сайты на месте, и вставка скорее всего, то что нужно.
Участник оффлайн! Alex2006
Постоянный участник
Берлин



 прочитанное сообщение 04.06.2014 19:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

(velekap @ 03.06.2014 16:42)
Ссылка на исходное сообщение  Проверил 8 и 4 колоний (2 Тф) - праймерами М13 и перекрестом М13-праймеры на ген. Выяснилось, что с клеток пцр лучше не делать-отжигаются где-то на хромосоме. Пока выделил две плазмиды и их проанализировал. Пока не те.

Чисто с М13 я вижу минимальный фрагмент, вот М13 с праймерами на ген дают неспецифику в пцр с клеток.


Почему тогда не провести скрининг клонов м13 праймерами?
2,4 даже 8 - это мало. Если количество белых колоний позволяет - проверьте 20-30 м13 праймерами. Только время отжига выставьте на "фрагмент со вставкой", а не на минимальный.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.06.2014 19:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

да тут много странностей, и эта- минорная
Участник оффлайн! Alex2006
Постоянный участник
Берлин



 прочитанное сообщение 04.06.2014 19:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

у него белых колоний много, как я понял. Прежде чем траблшутить весь протокол, логично проверить разумное число колоний и удостовериться, что нужного клона на плашке нет.

есть ощущение, что перескочив щас на субклонирование в левые вектора и на левые пятиминутные протоколы, автор накосячит еще больше
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  27.11.2021 15:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

https://archives.profsurv.com/forum/Profess...ert/-67881.aspx
https://atlanta.bubblelife.com/community/an...ex_Watch_Online
https://gumroad.com/rolexrelicawatches/p/di...replica-watches
https://onmogul.com/stories/guide-on-how-to...ex-watch-online
https://list.ly/i/5704105
https://www.behance.net/gallery/114237003/Replica-Rolex
https://www.mlbdailydish.com/users/Replicarolexwatches
http://replicawatches24.simplesite.com/
https://watcheshutuk.cabanova.com/
https://www.pinterest.com/watcheshutuk/_saved/
https://www.linkedin.com/pulse/guide-how-pu...online-hei-bai/
https://justpaste.it/8t11q
https://padlet.com/watcheshutuk/in2opwnfmnmclce8
https://www.allforxi.com/users/Replicarolexwatches
https://profile.hatena.ne.jp/Rolexrelicawatches/profile
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  28.12.2022 10:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

https://diigo.com/0pigcp
https://penzu.com/p/847cc342
https://writer.zoho.com/writer/open/k3enw4d...b0a3d8cf13c901a
https://eatsleepride.com/c/383274
https://anotepad.com/notes/byixar75
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...tches-930507835
https://form.jotform.com/223253469189061
https://padlet.com/omegawatches89/fvf9g8yhawsjurox
https://anotepad.com/notes/9393ncw8
https://www.crokes.com/omegawatches89/info/
https://www.merchantcircle.com/omegawatches89-houston-tx
https://trello.com/b/kEnu4Gm0/rolex-replica
https://www.instapaper.com/u
https://form.jotform.com/223253136113039
https://www.pinterest.com/pin/957859414473160488/
https://www.pinterest.com/pin/957859414473160566/
https://www.pearltrees.com/omegawatches89#item456651188
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040003/

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 12:33
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft