Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Выделение pDNA (минипреп - лизис щелочью) -- comments to a permanent page of the site --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Тема связана с: Минипреп - лизис щелочью
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Forum robot
Постоянный участник
на сервере в Москве



 прочитанное сообщение 18.08.2006 09:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Комментарии к постоянной странице сайта: Выделение pDNA (минипреп - лизис щелочью)

Выделение плазмидной DNA (минипреп - лизис щелочью). Лучший метод для получения pDNA высокого качества (годится даже для трансфекции). Его преимущества: очень низкая цена, высокая скорость (сравнима только с Qiaprep spin). Источник: Lee SY, Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA. Biotechniques. 1990 Dec; 9(6):676-9.
Участник оффлайн! Gosh
Участник
Berlin



 прочитанное сообщение 27.09.2006 14:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

У меня вопрос, будет ли данный BAC пригоден для субклонирования?
Гость
IP-штамп: fre3LvFwDEw82
гость



 прочитанное сообщение 27.09.2006 16:44     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Объясните, пожалуйста, в каких случаях ДНК лучше растворять в воде, а к каких - в ТЕ?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 27.09.2006 19:21     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Вода, если недолгое хранение, но главное, с последующими реакциям в магниевых буферах, ТЕ если на длительное хранение или какая проба форезная для многоразового использвания и тд.
Гость
IP-штамп: fr1hCWLfmRvPM
гость



 прочитанное сообщение 17.10.2006 07:03     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

скажите, пожалуйста, при каком g или rpm центрифугировать?
guest: ммм
IP-штамп: frHvyGooYAnV2
гость



 прочитанное сообщение 17.10.2006 09:13     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

---скажите, пожалуйста, при каком g или rpm центрифугировать?

Какой материал или на какой стадии выделения плазмиды, уточните.
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.10.2006 10:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(guest: ммм @ 27.09.2006 20:21)
Ссылка на исходное сообщение  Вода, если недолгое хранение, но главное, с последующими реакциям в магниевых буферах, ТЕ если на длительное хранение или какая проба форезная для многоразового использвания и тд.

вообще, старайтесь избегать использования ЕДТА, т.е. вместо ТЕ используйте просто 5-10 мМ Трис, и никакой воды. Трис нейтрального рН предотвратит гидролиз ЛНК, и ничему не помешает. А ЕДТА- это пережиток старых времен, когда Mg очень боялись, сейчас вроде методы поячище стали (а вот руки 0 нет, да...)
Гость
IP-штамп: frvlg5HAE9.1Q
гость



 прочитанное сообщение 17.10.2006 11:38     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

меня интересует какое g или rpm на всех стадиях, в приведенной методике ни для одной стадии это не указано.
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.10.2006 12:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

все просто, если подумать головой, при этом интервалы g сильно варьируют без видимых различий в результате. Так вот- клетки- чтобы не полопались, надо крутить не более 3-5 тыс об., осветление лизата- макс, тут ничего не испортишь, равно как и все последующие стадии- 10-12 тыс. Меньше- ДНК садится хуже, что очевидно. Избегаите охлаждения- на выход ДНК не влияет, а вот соли попадают лишние

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Atropos
Гость
IP-штамп: fr1hCWLfmRvPM
гость



 прочитанное сообщение 17.10.2006 13:23     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

спасибо! постараюсь подумать головой:)
Гость
IP-штамп: frYnkP4R1lFec
гость



 прочитанное сообщение 18.10.2006 10:27     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Скажите, пожалуйста, для чего добавляется AcONH4.
Гость
IP-штамп: frYnkP4R1lFec
гость



 прочитанное сообщение 18.10.2006 10:30     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

что такое ТЕ?
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.10.2006 10:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

вот AcONH4 не надо, следы аммония ингибируют например, лигазу. воспользуйтесь ацетатом калия. Вообще, это соли, которые спрособствуют высаживанию ДНК из спиртовых растворов. А ТЕ- ну, почитайте в конце концов
Гость
IP-штамп: frvlg5HAE9.1Q
гость



 прочитанное сообщение 18.10.2006 11:21     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Скажите, пожалуйста, у меня плазмида pCMV-Tag2 для экпрессии белка. После стадии 14 (после центрифугирования с изопропанолом) образуется осадок, который в дальнейшем не растворяется в воде.
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.10.2006 13:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

е-мое, что за степ 14 и сколько их всего? Конкретно Вашей методы не видел, но они все об одном, различия в деталях. Осадок не растворяется по тому, скорее всего, сто это и не может раствориться- дебрис небось прихватили после осветления раствора после добавления ацетатного буфера. Не растраивайтесь, ДНК-то растворилась, посмотрите на форезеб а нерастворимое дерьмо выкиньте в педальное велдро
Гость
IP-штамп: frYnkP4R1lFec
гость



 прочитанное сообщение 18.10.2006 13:57     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

большое спасибо! вроде разобрался.
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.10.2006 14:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

если дальше будут вопросы- пишите в личку или майл, так проще
Участник оффлайн! green mouse
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.10.2006 19:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Мне больше нравится лизис кипячением. по маниатису. там только один тонкий момент - в кипяток надо опускать СРАЗУ после добавления лизоцима и держать 40 секунд
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.10.2006 10:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

чтоб лизоцим поскорее сдох?-тогда зачем егл вллбще добавлять?
Участник оффлайн! green mouse
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.10.2006 18:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

все что надо он лизирует за несколько секунд. это же минипреп. а если не добавлять, то клетки не полопаются при кипячении, если передержать, то геномная днк тоже выделится.
главное, плазмида, так выделенная, всегда ярко светится на форезе. надо будет методику выложить shuffle.gif
Guest
IP-штамп: frdk4fFh7od4A
гость



 прочитанное сообщение 21.10.2006 12:50     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Я думал, яркость свечения на форезе зависит исключительно от количества пДНК, а не от метода, которым ее выделяли...
Guest
IP-штамп: frFNQ1Yb4qZoo
гость



 прочитанное сообщение 21.10.2006 21:45     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

(green mouse @ 18.10.2006 19:43)
Ссылка на исходное сообщение  Мне больше нравится лизис кипячением. по маниатису. там только один тонкий момент - в кипяток надо опускать СРАЗУ после добавления лизоцима и держать 40 секунд


мне больше нравится выделять квайджиновским китом wink.gif
хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было smile.gif
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.10.2006 23:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

еще Клонтеховкий неплох. Да все это одно и тоже, народ, о чем спорить? Я вот, не беру в руки лизоцим уже...лет эдак 10. И кто бы мне сказал, что плазмида плоха, не режется или не секвенируется, или еще что. А некоторые делают еще как-то. При этом жизнь все равно как-то идет вперед
Guest
IP-штамп: frV5vmRe1gSXQ
гость



 прочитанное сообщение 22.10.2006 00:49     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(Guest @ 21.10.2006 21:45)
Ссылка на исходное сообщение  мне больше нравится выделять квайджиновским китом wink.gif
хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было smile.gif

А скажите, у вас хорошо хранится ДНК, выделенная китами? У меня почему-то хранится значительно хуже, чем выделенная ручками с солями; через полгода-год многие препараты, выделенные китами, выглядят развалившимися на форезе, или после рестрикции выглядят как сплошной шмер.
Как у вас с этим?
Участник оффлайн! Atropos
Постоянный участник
abroad



 прочитанное сообщение 22.10.2006 23:58     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

(curious67 @ 18.10.2006 11:42)
Ссылка на исходное сообщение  вот AcONH4 не надо, следы аммония ингибируют например, лигазу

А зачем pDNA лигазить или киназить? confused.gif

Да и вообще лигазу он похоже не ингибирует, USB, например, пишут:
Inhibitors: Na (>0.2M), K (>0.2M)

Сообщение было отредактировано Atropos - 23.10.2006 00:14
Участник оффлайн! Atropos
Постоянный участник
abroad



 прочитанное сообщение 23.10.2006 00:17     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

(Guest @ 21.10.2006 22:45)
Ссылка на исходное сообщение  мне больше нравится выделять квайджиновским китом wink.gif
хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было smile.gif

У Эппендорфа и Сигмы так вообще есть пятиминутные киты. smile.gif Прогресс идёт. smile.gif
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.10.2006 13:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

что пишет USB, я не знаю, кладу только те ионы, которые встретятся потом в буферах для всяких реакций- логично? Тем более, что трезультат будет тем же.
А что до хранения- не замечал, чаще всего плазмида идет на сиквенс, два дня, а дальше может, и не надо будет. Словом, тут ничего сказать не могу, но жалоб пока не было (от вторичных пользователей моих плазмид, к примеру)
Участник оффлайн! green mouse
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 23.10.2006 19:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

(Guest @ 21.10.2006 13:50)
Ссылка на исходное сообщение  Я думал, яркость свечения на форезе зависит исключительно от количества пДНК, а не от метода, которым ее выделяли...

я сначала тоже так думала, а потом мне кто-то сказал, что минипрепом оно столько не выделяется shuffle.gif
Участник оффлайн! green mouse
Участник
Москва



 прочитанное сообщение 23.10.2006 19:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

(curious67 @ 22.10.2006 00:43)
Ссылка на исходное сообщение  еще Клонтеховкий неплох. Да все это одно и тоже, народ, о чем спорить? Я вот, не беру в руки лизоцим уже...лет эдак 10. И кто бы мне сказал, что плазмида плоха, не режется или не секвенируется, или еще что. А некоторые делают еще как-то. При этом жизнь все равно как-то идет вперед
дайте денег! wall.gif дайте мне много денег! wall.gif

Сообщение было отредактировано green mouse - 23.10.2006 19:18
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 24.10.2006 09:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

на самом деле денег не надо (то есть, конечно , всегда надо, но обсуждается не это) для успешного выделения плазмид, все отлично делается вручную, за копейки, и по времени не сильно отличается. Единственно, что если у Вас большой поток, то киты спасают, а если штуки до 20 примерно, то глобальной разницы нет. Да, и учтите, что вручную всегда больше выход ДНК

Сообщение было отредактировано curious67 - 24.10.2006 09:59

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): green mouse, Atropos
Участник оффлайн! Atropos
Постоянный участник
abroad



 прочитанное сообщение 01.11.2006 11:26     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

Интересно, а что такое нужно в 3-й раствор добавить, чтобы осадок после нейтрализации/ЦФ всегда был маленьким компактным как в QIAprep Miniprep? Это из-за хаотропной соли?

P. S.
В итоге пришёл к выводу, что нужно просто посильнее/посмелее трясти при перемешивании и перед ЦФ. =)

Сообщение было отредактировано Atropos - 12.10.2007 22:35
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 01.11.2006 11:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

3-й раствор- это всегда либо ацетат (калия), либо гуанидин изотиоцианат сам по себе (редко) или в смеси с тем же ацетатом. В ручном выделении- просто ацетат, так что добавление хаотропов как раз и дает более компактный осадок

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Atropos
Участник оффлайн! Alexkiev




 прочитанное сообщение 27.07.2007 17:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

Скажите пожалуйста, а что если я делал по такому же принципу, без колонок, но раньше не проделывал дважды пункты с КАс и изопропанолом? От этого что-либо меняется? Изменяться ли результаты последующего за этим фореза, имею виду неточности??? Особенно, если я потом буду резать данную плазмиду и пускать на ПЦР???
guest: Студент
IP-штамп: fr4MbcymAiCcU
гость



 прочитанное сообщение 10.08.2007 18:03     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование
Вопрос
Уважаемые молекулярные биологи, скажите пожалуйста, можно ли останавливать процесс выделения плазмидной ДНК в данной методике в пункте 16:
« 1. + 100µl 2М AcONH4, вортекс 20'';
2. NT, 5'; »
«Устранение большей части рибосомной RNA. В высокой соли одноцепочечная RNA образует большие ассоциаты (может быть за счет случайной гибридизации) и не растворяется.»

Убрать образцы на -20 и продолжить выделение на следующий день. :confused:

А то я сначала сделал, потом подумал. :shuffle: :teapot:
Участник оффлайн! Atropos
Постоянный участник
abroad



 прочитанное сообщение 12.10.2007 22:30     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды;

При желании и на этом этапе можно прерваться, т. е. бросить эппендорф с осадком, например, на - 70.

Сообщение было отредактировано Atropos - 12.10.2007 22:45
Участник оффлайн! Atropos
Постоянный участник
abroad



 прочитанное сообщение 12.10.2007 22:32     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование
Шутка, забавная история
(guest: Студент @ 10.08.2007 19:03)
Ссылка на исходное сообщение  Уважаемые молекулярные биологи, скажите пожалуйста, можно ли останавливать процесс выделения плазмидной ДНК в данной методике в пункте 16:
Убрать образцы на -20 и  продолжить выделение на следующий день. confused.gif

А то я сначала сделал, потом подумал. shuffle.gif  teapot.gif

Как-то раз так делал, когда рабочий день на кафедре неожиданно закончился shuffle.gif, никаких отрицательных последствий не заметил.
Участник оффлайн! Atropos
Постоянный участник
abroad



 прочитанное сообщение 12.10.2007 22:42     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование
Вопрос
п.2. - ещё 2 раза;
ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды;


Кстати, у кого какой опыт по поводу пользы дополнительной стадии ресуспендирования в р-ре I и осаждения (перед п. 5)?

В Маниатисе в принципе рекомендуют

The penalty for failing to remove all traces of medium from the bacterial pellet is a preparation of  plasmid DNA that is resistant to cleavage by restriction enzymes. This is because cell-wall components in the medium inhibit the action of many restriction enzymes. This problem can be avoided by resuspending the bacterial pellet in ice-cold STE @.25x volume of the original bacterial culture)
and centrifuging again.

но сравнивать как-то лень всегда было, то делал, то нет, по настроению. На практикуме такую стадию вроде делали.
Гость
IP-штамп: frG/ehwVgdnf.
гость



 прочитанное сообщение 20.10.2007 20:51     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

Раствор 1 - просто трата времени, даже для максипрепа. Виход плазмиды тот же , а качество не обижает!
Участник оффлайн! PPK Rattus




 прочитанное сообщение 21.12.2007 17:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

А так ли обязательны пп.17-22 для препаратов на форез ? У Маниатиса их вроде не было.
Как я понял, их основной смысл - очистка от RNA. Может ли наличие RNA существенно ускорять полоску в геле (в 3-4 раза)?

Когда мы пробовали с ними, под конец этой многократной очистки ИПСом осадка уже не было видно. Или так и должно быть?
И, кроме того, в конце предлагается растворять в 25мкл буфера, но это сильно мало для последующей очистки фенолом-хлороформом (трудно отсасывать такие мелкие количества верхней фазы).
Или после такой очистки можно сразу добавлять буфер для внесения - и в лунки?

Сообщение было отредактировано [PPK] Rattus - 21.12.2007 17:17
Участник оффлайн! petr
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.12.2007 21:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

Вот только ща прочитал все. Какой-то мудреный метод, а потерь при нескольких переосаждениях будет много.
Если выделять не китом (Кваген мидипреп пользую), то:
1. в раствор I сразу налить РНКазу (собсна Квагеновцы так и делают)
2. после инкубации в р-ре III (NaAc или NH4Ac) и открутки, супер надо отфенолить и отхлороформить (там же белков как грязи! потом после изопропанола хрен чего растворишь), и только потом осаждать.
3. после растворения осадка дополнительные очистки - по вкусу.

2 гость IP-штамп: frG/ehwVgdnf: Ну да, для минипрепа вместо раствора 1 пользую воду. Для миди - не пробовал.
Участник оффлайн! PPK Rattus




 прочитанное сообщение 22.12.2007 08:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

(petr @ 21.12.2007 23:43)
в раствор I сразу налить РНКазу
Обязательно? Какую? Сколько? Этого достаточно, чтобы убрать всё, что помешает форезу?

Сообщение было отредактировано [PPK] Rattus - 22.12.2007 08:07
Участник оффлайн! petr
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2007 08:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

РНКазу-А. Сколько - поц-кажу завтра (ща под рукой нет протокола). Да, уберет все.
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.12.2007 23:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #43 множественное цитирование

открою Вам глаза на мир, хоть и лень писать, общее же место. Не знаю, какую идиотическию процедуру Вы там обсуждаете, похоже на бред. Выделять минипреп надо так- все в ультимативной форме, ибо практика- критерий истины, а то, что подставляюсь под всякие там "критические" замечания- по хренам. Имеющий уши...
Итак, записывайте:
1) крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс, 60-75 сек
2) ресуспендируем в растворе 1 (300-400 мкл 10 мг/мл раствора РНКазы на 10-12 мл по фиг чего, допустим, 20 мМ Трис или РВS)- 250 мкл
3) добавляем 250 мкл раствора 2 (стандартная NaOH-SDS), 5 мин при нежном перемешивании до полупрозрачной сопли
4) 350 мкл 3 М КAc рН 4.8-5.2 (3М по К, 5 М по ацетату- по Маниатису). Интенсивно перемешиваем переворачиванием пробирки (не вортекс!) до образования творожистой взвеси. раствор уже не вязкий.
5) крутим 10 мин на макс
6) переносим все 850 мкл в 700 мкл изопропа, перемешиваем на вортексе хорошенько
7) 10 мин на макс
8) Имеем компактный осадок, размер которого зависит от: а) от копийности плазмиды, б) от наличия или отсутствия РНК. Изопроп удаляем, остаточное его количество коротко сбрасываем на минифуге и до-отбираем досуха
9) Промываем (здесь аккуратнее- изопропные осадки можгут отделяться от стенки) 80% этанолом, произвольное количество, спирт удаляем, остатки его- также на минифуге и до-отбираем досуха
10) СУШИМ 5 МИН НА 42-44 оС
11) растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0. Все
Количество для нормальных плазмид типа pBlueScript или pGEM- 200-500 нг/мкл и выше, для менее копийных типа pQE или pET -от 50 нг/мкл и выше
Качество- аналитическая рестрикция и сиквенс- ОК, для количественной рестрикции , трансфекции- надо фенолить
На форезе- иногда много суперкойла, иногда в основном релакс, что ни хорошо и ни плохо. При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить
Вот и все. Проще метода не бывает, воспроизводимость -100%, количества достаточные, траха- мин

Сообщение было отредактировано curious67 - 26.12.2007 14:09

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): [PPK] Rattus, Atropos
Ъ
IP-штамп: frWBxqPTDNeUI
гость



 прочитанное сообщение 23.12.2007 00:15     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #44 множественное цитирование

(curious67 @ 22.12.2007 22:01)
Ссылка на исходное сообщение  открою Вам глаза на мир, хоть и лень писать

Но ничего нового и принципиального... confused.gif Но я все равно благодарю за то, что не поленились и высказались (эмоционально!). smile.gif В любом случае полезно, не только для начинающих. umnik.gif
Участник оффлайн! petr
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.12.2007 04:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #45 множественное цитирование

(curious67 @ 22.12.2007 20:01)
Ссылка на исходное сообщение  
3) добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS), 5 мин при нежном перемешивании до полупрозрачной сопли

5мин многовато. Достаточно 2-х мин. Вообще клетки лизируются моментально, главное аккуратно перемешивать
Все равно, после отбора супера (после высаливания, перед осаждением изо-, хотя я всегда осаждал этанолом) я б отфенолил/отхлороформил, тогда ничего греть не придется (кстати, однажды открутил чачу, которая не растворилась даже при кипячении, а при следующей открутке, супер на форез -> шмер).
В остальном - это ж классика, когда нет кита под рукой. smile.gif

Сообщение было отредактировано petr - 23.12.2007 04:14
Участник оффлайн! petr
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.12.2007 04:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #46 множественное цитирование

(petr @ 22.12.2007 05:52)
Ссылка на исходное сообщение  РНКазу-А. Сколько - поц-кажу завтра (ща под рукой нет протокола). Да, уберет все.

Да, до работы сегодня так и не добрался. Но что-то у меня в голове крутиццо - стоковый раствор РНКазы 10мг/мл, конечная концентрация 10мкг/мл. Возможно вру, как буду в лабе посмотрю.
Кстати, если растворяете сухую РНКазу, добавьте к ней немного EDTA (этак 10мМ чтоб было) и прогрейте этак на 80оС минут 10-15. Она всегда загрязнена ДНКазой.
Странно, но РНКаза вроде не боится кипячения, но почему-то однажды я вскипятил ее, и она сдохла...

Сообщение было отредактировано petr - 23.12.2007 04:20
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 24.12.2007 17:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #47 множественное цитирование

все так, разумеется, классика, однако 40 с лишним постов мусолят эти вот общие места. Что до фенола/хлороформа перед высаживанием изопропом, никогда не делаю, все растворяется нацело, если, конечно, в изопроп не попал ацететный дебрис. А про 5 мин в щелочи- можно и меньше, я в это время курю, точный хронометраж не веду
Участник оффлайн! PPK Rattus




 прочитанное сообщение 26.12.2007 13:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #48 множественное цитирование

>крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс
А 3 раза по 1,5мл можно? А то в эпендорф больше не влезает. shuffle.gif
А если на 12 тыс. 2' можно?

>добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS)
Вы, наверное, хотели сказать "раствора2" ?

>КAc
А AcONH4 не сильно хуже? А то ацетеата калия у нас вроде нету...

>на макс
В смысле на максимуме оборотов?

>При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить
А без РНКазы точно никак для фореза?

>растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0
А трудоемкость с феноленьем таких небольших количеств не возникает?
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 26.12.2007 14:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #49 множественное цитирование

([PPK)
Rattus,26.12.2007 13:19]Ссылка на исходное сообщение  >крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс
А 3 раза по 1,5мл можно? А то в эпендорф больше не влезает. shuffle.gif
А если на 12 тыс. 2' можно?

Ответ: во-первых, 1,5 мл пробирки менее удобны, ибо дно заужено и перемешивание плохое, особенно в вязкой среде после добавления щелочи
во-вторых, 12 тыс нельзя, клетки полопаются. И 2 мин не надо, 60-75 сек на 10 тыс. вполне достаточно

>добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS)
Вы, наверное, хотели сказать "раствора2" ?

Ответ: спасибо, уже исправил

>КAc
А AcONH4 не сильно хуже? А то ацетеата калия у нас вроде нету...

Ответ:
Аммонийных солей надо намного больше, если не ошибаюсь, 1/3 от объема- было как-то в древних методах. Все же надо б найти калий, это пустяк

>на макс
В смысле на максимуме оборотов?

Ответ:- разумеется

>При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить
А без РНКазы точно никак для фореза?

Ответ: РНК вообще-то ничему не мешает, но этидий на себя сосет, и если РНК много, то ДНК (идущая сверху) недокрашивается- можно сильно недооценить ее (ДНК) количество со всеми вытекающими...

>растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0
А трудоемкость с феноленьем таких небольших количеств не возникает?

Ответ:
Если фенолите, то разбавьте раза в 2, потери будут меньше. А если не фенолить, то 50-70 мкл- как раз тот объем, которые даст Вам удобные концентрации плазмиды для последующих манипуляций


Сообщение было отредактировано curious67 - 26.12.2007 14:09

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): [PPK] Rattus
Участник оффлайн! PPK Rattus




 прочитанное сообщение 26.12.2007 14:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #50 множественное цитирование

>во-первых, 1,5 мл пробирки менее удобны, ибо дно заужено и перемешивание плохое
Что-ж делать, чем богаты, тем и рады... :[

>12 тыс нельзя, клетки полопаются.
Но их же всё равно потом лизировать?

>А если не фенолить
Для неколичественного фореза необязательно?

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 04:17
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft