Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Forum robot Постоянный участник на сервере в Москве |
Предотвращение загрязнения и неспецифической амплификации при PCR. Обработка поверхностей, пластика и компонентов реакции. Чувствительность ПЦР-фрагментов различной длины к ультрафиолету. |
_Алишер_ IP-штамп: frftLGqhpFF.A гость |
|
Гость IP-штамп: frftLGqhpFF.A гость |
С чем связано мистическое указание не готовить новую ПЦР, если сегодня гнали форез? Может быть, с фазами луны? |
_Cold2_ IP-штамп: frftLGqhpFF.A гость |
|
_poanik_ IP-штамп: frftLGqhpFF.A гость |
(Гость @ 11.01.2006 02:52) Это к сообщению Андрея Попова из Дубровиц С чем связано мистическое указание не готовить новую ПЦР, если сегодня гнали форез? Может быть, с фазами луны? Всё просто: на одежде, руках, подошвах обуви и т.д. могут остаться продукты ПЦР. Поэтому лучше перестраховаться, чем потом искать источник контаминации. |
Гостинец 1 IP-штамп: frVUncTC1Qf86 гость |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
Если быть серьезным, то, чаще всего устранение загрязнений PCR проще и надежнее всего достигается устранением вполне конкретных и определенных личностей, эти загрязнения регулярно привносящих. В отсутствии подобных субъективно-личностных факторов загрязнение PCR, если таковое имеет место быть, устраняется соблюдением элементарных правил, никак не отраженных в материале, любезно предоставленном Алексеем и Андреем, а именно: 1. Никогда не использовать никакой расходный пластик вторично! 2. Использовать только filter tips (носики с фильтрами). 3. Хранить расходный пластик в герметично закрытых банках/коробках. 4. Не лапать никакой расходный пластик руками, доставать из банки/коробки только пинцетом. 5. Всегда следовать золотому правилу молекулярной биологии: один носик – одно пипетирование! 6. Аккуратно открывать PCR пробирки/стрипы/плашки, предотвращая разбрызгивание, для чего их достаточно немного открутить. 7. После применения собирать весь расходный пластик в полиетиленовые пакеты и сразу же выбрасывать. 8. Аликвотить реактивы и растворы небольшими порциями, хранить запасы и реактивы используемые в настоящий момент отдельно. 9. При подозрении на загрязнение реактивов безжалостно выбрасывать все компоненты, использованные в реакции, и начинать с новых аликвот/упаковок. Желаю успехов!
|
бутанол Постоянный участник Новосибирск |
|
genseq Постоянный участник |
|
Carbon Copy Постоянный участник So close no matter how far |
(genseq @ 15.01.2006 06:59) Основные загрязнители почему-то пропущены. Это форез. И гели, и буфер содержат огромное количество ампликонов. На электродах выделяются пузырьки кислорода и водорода, которые лопаются на поверхности буфера и дают мельчайший аэрозоль, загрязняющий всё помещение. Вы это серьезно? Это ж какая концентрация ампликонов должна быть в буфере, чтобы форезным аэрозолем загрязнить все помещение? IMHO это - одна из живучих научных легенд, передаваемых из уст в уста лаборантами/ студентами/ аспирантами и используемых для оправдания элементарной криворукости и неаккуратности. Посудите сами, чтобы ампликоны оказались в буфере, необходимо как минимум, чтобы предыдущий форез убежал и чтобы Вы использовали этот буфер вторично. Как часто это с Вами случается? К тому же давно прошли времена, когда форезные ванночки клеили сами эпоксидкой, все давно гоняют форезы в закрытых аппаратах с крышкой.
|
Гость IP-штамп: frdR6q/GGP2VM гость |
|
guest: Гость IP-штамп: fr183ATt8MD8k гость |
Согласна!!!! Особенно это легенда распростроняется в диагностических лабораториях... где ничего нормално не организовано, фиг знает какие реактивы, но виноваты исклучително ампликоны :lol: |
Лиснигнах |
2. Поделить лабу на преПЦР и постПЦР зоны, пипетки, коробки с типсами и перчатки туда-сюда не таскать. 3. Пробирки/плашки движутся строго в одном направлении: преПЦР-постПЦР-мусорка. Сиквенсы и т.п. месить на постПЦР зоне. Плашки, заклеенные липкой пленкой, открывать особенно аккуратно - лучше либо в замороженном состоянии, либо сразу после амплификатора (с горячих плашек отстает хорошо) - иначе недолго уделать все и вся вокруг. 4. За нарушения регламента бить морду.
|
guest: Гость IP-штамп: fr183ATt8MD8k гость |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 05.11.2007 03:31) Юр - гелъ ставь - полосочки вырезай - клонируй - сиквенируй - ВНУТРИ ЗАКРЫТОЙ ПРОБИРКИ Ну так прям тебя и представил внутри еппендорфа 0.5 мл как ты в пробирке копашишся |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Guest @ 05.11.2007 11:13) Юр - гелъ ставь - полосочки вырезай - клонируй - сиквенируй - ВНУТРИ ЗАКРЫТОЙ ПРОБИРКИ Ну так прям тебя и представил внутри еппендорфа 0.5 мл как ты в пробирке копашишся If you can't work in closed format, you need to burn your lab to the ground after each gel you run. (Just kidding) The problem of contamination in PCR is not really a scientific problem; it is a problem of poorly trained and/or underpaid personel working in high tech environment. |
Ъ IP-штамп: frWBxqPTDNeUI гость |
Важно не соблюдение целого ряда (на всю страницу) антиконтаминационных мер, а понимание откуда происходит ЭТО. Меры у вас автоматически сами появятся. |
ChainiK IP-штамп: frxcIGlR1Rnxc гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 05.11.2007 18:04) Иф ёу цаньт щорк ин цлосед формат, ёу неед то бурн ёур лаб то тхе гроунд афтер еач гел ёу рун. (Юст киддинг) Тхе проблем оф цонтаминатион ин ПЦР ис нот реаллы а сциентифиц проблем; ит ис а проблем оф поорлы траинед андор ундерпаид персонел щоркинг ин хигх теч енвиронмент. Кстати - могу безплатную рекламу для праймер компаний "Суицид ПЦР" Самая крутая ПЦР в мире В основе - ОДНОРАЗОВЫЕ ПРАЙМЕРЫ - сделал ПЦР с одной парой на чуму- "Черная Смерть" - след ПЦР с НОВОЙ парой праймеров чтоб без КОНТАМИНАЦИИ |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(ChainiK @ 07.11.2007 04:22) Q: Ну и ещё один "гемморой" как вопрос "что есть сток", а именно, нужно ли чистить ПЦР продукт (длинный кусок 16S rDNA) перед ре-ампилификацией... что скажут корифеи? (слышал версий много - аж 3, придерживаюсь одной) No. Just dilute it. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Guest @ 07.11.2007 14:05) Кстати - могу безплатную рекламу для праймер компаний "Суицид ПЦР" Самая крутая ПЦР в мире В основе - ОДНОРАЗОВЫЕ ПРАЙМЕРЫ - сделал ПЦР с одной парой на чуму- "Черная Смерть" - след ПЦР с НОВОЙ парой праймеров чтоб без КОНТАМИНАЦИИ I'm not sure I would rely on a system that lacks positive control ;-)) |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Yuri K @ 07.11.2007 16:33) в чем проблема ? - в америке добровольцы-бойскауты повывелись? |
Guest IP-штамп: frPanb9Lvzu1g гость |
Имеется в виду, разумеется, ситуация, когда из раза в раз используется один и тот же "набор" праймеров - и перейти временно на другие ( как, собственно, и проще всего решить проблему в случае загрязнения) не предствляется возможным - по всяким ненаучным соображениям ( вроде GMP документации и т.п. ). |
Guest IP-штамп: fraDhfRXD5Beo гость |
|
Guest IP-штамп: frPanb9Lvzu1g гость |
(Guest @ 09.03.2008 20:33) - конечно, попробовали. Один из восьми регулярно тестируемых в панели "обязательных" амплифицируется значительно хуже уже при переходе на Hotstar, а с dUTP ( в т.ч. и с повышенной концентрацией) практически не виден . Не скажу, чтобы меня донимали и раньше загрязнения - пока не наблюдались, но "от греха подальше " и чтобы ублажить инспекции , раз так рекомендуют, стал работать в этом "скворечнике". Хуже точно не стало - но лучше ли? ведь проблему, вопреки классику жанра, решил "до ее поступления" . Потому и спросил - может, есть такие, что без "ПЦР кабинета" бедствовали", а с ним круто изменилась жизнь?
|
Гость IP-штамп: frT//m0DxIWZA гость |
|
Guest IP-штамп: fr32TkPWTePOw гость |
по поводу УФ - я "освещаю" перед работой все кроме полимеразы и праймеров. минут по 3-4. не знаю правильно или нет. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 07.09.2010 08:59) ага.....все конечно правильно и замечательно, но как бороться с теми, кто считает что ПЦР-ить можно в комнате с электрофорезом, обратной транскрипцией и до кучи с ИФА-методиками ( кстати тут об этом ничего не написано ) а если в преПЦР-ной мойка? а если холодильник для реактивов один на всех и все? что делать? по поводу УФ - я "освещаю" перед работой все кроме полимеразы и праймеров. минут по 3-4. не знаю правильно или нет. Мадонна, "освещать все" УФ 3-4 мин - это поцелуи через стекло. |
RJ Dio Постоянный участник |
(Лиснигнах @ 04.11.2007 09:56) 1. Типсы не стоит держать навалом в банках - есть коробки 96-дырочного формата. Тогда необходимость лапать их хоть руками, хоть пинцетом отпадает в принципе - достаточно ткнуть пипеткой. 2. Поделить лабу на преПЦР и постПЦР зоны, пипетки, коробки с типсами и перчатки туда-сюда не таскать. 3. Пробирки/плашки движутся строго в одном направлении: преПЦР-постПЦР-мусорка. Сиквенсы и т.п. месить на постПЦР зоне. Плашки, заклеенные липкой пленкой, открывать особенно аккуратно - лучше либо в замороженном состоянии, либо сразу после амплификатора (с горячих плашек отстает хорошо) - иначе недолго уделать все и вся вокруг. 4. За нарушения регламента бить морду. к последнему тезису особо присоединяюсь. Все верно. Если кто сомневается- до первого засора и полной дезактивации помещения (если. конечно. задача того требует). |
Guest IP-штамп: fr32TkPWTePOw гость |
(RJ Dio @ 07.09.2010 11:28) к последнему тезису особо присоединяюсь. Все верно. Если кто сомневается- до первого засора и полной дезактивации помещения (если. конечно. задача того требует). по тридцать-сорок. на клавиатуре оторвали ноль. гады. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 09.09.2010 10:28) А по 30-40 мин - это уже долгий поцелуй,... возможно с засосом , но опять же - через стекло. Бесполезно. только воздух обеззараживаете и насыщаете всякими вредными радикалами. |
VVolkov Постоянный участник |
Борьба с загрязнениями при PCR UV облучение Урацил ДНК гликозилаза Загрязнение поверхностей Дополнить Алексей Солдатов Андрей Попов /ВИЖ, Дубровицы/ Наиболее распространённый способ - UV облучение |
VVolkov Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |