Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
curious67 Постоянный участник |
([PPK] Rattus @ 26.12.2007 14:14) >во-первых, 1,5 мл пробирки менее удобны, ибо дно заужено и перемешивание плохое Что-ж делать, чем богаты, тем и рады... :[ если нет возможности купить нужный пластик, непременно прекращайте мастурбировать с ДНК >12 тыс нельзя, клетки полопаются. Но их же всё равно потом лизировать? только Вы сначала СЛИВАЕТЕ СУПЕР, вместе с содержимым полопавшихся клеток. Включите мозги >А если не фенолить Для неколичественного фореза необязательно? для такого фореза, котрый Вы продемонстрировали во втором Вашем топике, можно все что угодно- все равно ничего не выйдет- в том бреде, кторый Вы написали, неправильно буквально все, начиная от СТАРОГО!!!!!!!!!! TBE и кончая неправильным режимом электрофореза. О качестве презентации результата и не говорю. Хотя...Я понимаю, чем богаты, тем и рады. Как это все назавается, я упомянул парой строчек выше
|
PPK Rattus |
ОК. Будем исправлять и пробовать. |
Гость IP-штамп: frh5mdI9nB8Yg гость |
|
The problem Постоянный участник |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(The problem @ 13.03.2008 09:35) да хоть 5, не имеет значения. Да и не только BlueScript- у Вас имеются различные формы плазмиды: суперкойл, куча разных релаксов, у всех у них разная подвижность из-за разной способности этидия интеркалировать в разные спирализованные формы. /расслабьтесь, у ВАс все нормально После рестрикции плазмиды 3 или 5 полос и расслабься Я бы не расслаблялся... |
The problem Постоянный участник |
|
Гость IP-штамп: frh5mdI9nB8Yg гость |
|
Гость IP-штамп: frsLZLBWSuTBM гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
RNA-зу, прокипятите в кипяще бане минут 20 преред использованием. Вся ДНКаза, и загнется. |
Anna-K213 |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
А она по идее сильно мешать недолжна. А так обработать РНКазой только без фанатизма достаточно 10-30мкг/мл, а потом фенолить, но от фенол надо хорошо избавится переосаждением спиртом и спирт-эфиром. Можно еще осадить РНКу 6М LiCl. Но это малоэфективно. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Anna_K213 @ 22.04.2008 12:46) Скажите, пожалуйста, как можно избавиться от пятна РНК в плазмидной ДНК , выделенной вручную? я хочу ее далее секвенировать. В более продвинутых протоколах (китах) РНК-аза используется до начала лизиса клеток. Так что возвращайтесь на исходные позиции, а готовую плазмиду освобождать от РНК-аз - дороже обойдется. Если это пятно не такое яркое, не обращайте внимание и секвенируйте - авось обойдется. |
Гость IP-штамп: frdk4fFh7od4A гость |
|
Lexey Харьков |
2) Теоретический. Откуда такая разница в концентрации плазмид, когда вместо LB используется МПА? |
викки |
Кто может подсказать почему TE буфер при выделении плазмиды мелодом щелочного лизиса дожен быть с рН именно 8.0????? |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(викки @ 10.09.2008 19:29) Товарищи! Кто может подсказать почему TE буфер при выделении плазмиды мелодом щелочного лизиса дожен быть с рН именно 8.0????? Независимо от метода, ТЕ всегда рН 8.0. Можно конечно с 8.5 и даже 9.0, но никак не меньше 8.0. и от метода выделения это не зависит. Кстати, сейчас весь мир использует только метод щелочного лизиса, а другие остались в 20 веке. |
викки |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(викки @ 11.09.2008 19:47) упс... немного некорректно выразилась... я имела ввиду, как именно это значение рН влияет на дальнейший ход работы... ????? сам TE используется как хелатирующий агент... перед детергентом(SDS)...это понятно... но ПОЧЕМУ именно 8.0? какую роль играет это значение? Никакой. Мелочи в жизни. Для сведения, при понижении рН ниже 8 ЭДТА начинает потихоньку выпадать в осадок или по-другому, при рН ниже 8 ЭДТА не растворяется в воде. |
PPK Rattus |
(Lexey @ 28.07.2008 15:13) 1) Кто нибудь пробовал эту методу для выделения плазмидного профиля из диких штамов? Если есть опыт, поделитесь! Необходимость только в форезе. У меня точно такая же задача стояла (см. выше). Полный алгоритм выделения, с щелочным лизисом и осаждением спиртом я пока оставил, поскольку он оказался весьма требовательным к чистоте реактивов.Взял поэтому за основу экспресс-метод 1. Ресуспендируем в 60 мкл. TE 2. Фенол-хлороформим дважды, потом хлороформим однократно (правда работает это вроде как только на Грам- бактериях: из лизирующих компонентов, как я понял, там только фенол и для толстого пептидогликана Гр+ его, по-видимому, недостаточно). 3. Полученный раствор (~45мкл) + 2 капли минерального масла (чтобы не испарился) прогреваем при 90°С ~4мин. и плавно остужаем (можно в руках) для ренатурации pDNA (иначе на форезе плазмида в виде разных конформаций пойдет несколькими полосами и не там, где надо) 4. Собираем 35-40мкл. из мод масла и хорошо смешиваем в новой пробирке с 5-6мкл. 1x буфера для внесения. 5. Вносим в лунки 0,8-0,9% геля и форезим 2ч. при 5в/см в 1x TBE буфере (гель нужен достаточно длинный). Выход, конечно, по меркам здешних суровых хтонических молбиологов будет дико слабый и грязный, но для фореза - достаточно. (Lexey @ 28.07.2008 15:13) 2) Теоретический. Откуда такая разница в концентрации плазмид, когда вместо LB используется МПА? В принципе можно и на том и на другом - и так и так выход есть видимый. Где больше, где меньше пока не замечал.
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |