Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Выделение pDNA (минипреп - лизис щелочью) -- comments to a permanent page of the site --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Тема связана с: Минипреп - лизис щелочью
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! curious67
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 26.12.2007 19:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #51 множественное цитирование

([PPK] Rattus @ 26.12.2007 14:14)
Ссылка на исходное сообщение  >во-первых, 1,5 мл пробирки менее удобны, ибо дно заужено и перемешивание плохое
Что-ж делать, чем богаты, тем и рады... :[

если нет возможности купить нужный пластик, непременно прекращайте мастурбировать с ДНК

>12 тыс нельзя, клетки полопаются.
Но их же всё равно потом лизировать?
только Вы сначала  СЛИВАЕТЕ СУПЕР, вместе с содержимым полопавшихся клеток. Включите мозги

>А если не фенолить
Для неколичественного фореза необязательно?

для такого фореза, котрый Вы продемонстрировали во втором Вашем топике, можно все что угодно- все равно ничего не выйдет- в том бреде, кторый Вы написали, неправильно буквально все, начиная от СТАРОГО!!!!!!!!!! TBE и кончая неправильным режимом электрофореза. О качестве презентации результата и не говорю. Хотя...Я понимаю, чем богаты, тем и рады. Как это все назавается, я упомянул парой строчек выше

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): [PPK] Rattus
Участник оффлайн! PPK Rattus




 прочитанное сообщение 26.12.2007 20:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #52 множественное цитирование

>только Вы сначала СЛИВАЕТЕ СУПЕР, вместе с содержимым полопавшихся клеток. Включите мозги.
ОК. Будем исправлять и пробовать.
Гость
IP-штамп: frh5mdI9nB8Yg
гость



 прочитанное сообщение 12.03.2008 16:55     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #53 множественное цитирование

сказите позалуйста, поцему ДНК пБлуесцрипт II К(+) после рестрикции, на електрефорезе имеет три стриха на снимке.
Участник оффлайн! The problem
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.03.2008 10:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #54 множественное цитирование

да хоть 5, не имеет значения. Да и не только BlueScript- у Вас имеются различные формы плазмиды: суперкойл, куча разных релаксов, у всех у них разная подвижность из-за разной способности этидия интеркалировать в разные спирализованные формы. /расслабьтесь, у ВАс все нормально
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 13.03.2008 10:56     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #55 множественное цитирование

(The problem @ 13.03.2008 09:35)
Ссылка на исходное сообщение  да хоть 5, не имеет значения. Да и не только BlueScript- у Вас имеются различные формы плазмиды: суперкойл, куча разных релаксов, у всех у них разная подвижность из-за разной способности этидия интеркалировать в разные спирализованные формы. /расслабьтесь, у ВАс все нормально

После рестрикции плазмиды 3 или 5 полос и расслабься confused.gif Я бы не расслаблялся... smile.gif
Участник оффлайн! The problem
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.03.2008 12:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #56 множественное цитирование

сорри, не заметил фразу про рестрикцию. Тады ой! Стало быть, сайтов у Вас много больше, чем должно быть. Или, что вероятнее, идет недорестрикт (детали неизвестны, сколько рестриктаз было в рестрикции)- надо дополнительно чистить плазмиду или же сменить фермент
Гость
IP-штамп: frh5mdI9nB8Yg
гость



 прочитанное сообщение 16.03.2008 22:21     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #57 множественное цитирование

болшое спасибо вам за ответ:)
Гость
IP-штамп: frsLZLBWSuTBM
гость



 прочитанное сообщение 21.04.2008 17:06     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #58 множественное цитирование

У кого-нибудь было такое,что после инкубации с RNA-зой рDNA деградировала? Если добавлять RNA-зу в GTE, то сколько?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 21.04.2008 17:25     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #59 множественное цитирование

--У кого-нибудь было такое,что после инкубации с RNA-зой рDNA деградировала? Если добавлять RNA-зу в GTE, то сколько?

RNA-зу, прокипятите в кипяще бане минут 20 преред использованием. Вся ДНКаза, и загнется.
Участник оффлайн! Anna-K213




 прочитанное сообщение 22.04.2008 13:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #60 множественное цитирование

Скажите, пожалуйста, как можно избавиться от пятна РНК в плазмидной ДНК , выделенной вручную? я хочу ее далее секвенировать.
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 22.04.2008 16:48     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #61 множественное цитирование

--Скажите, пожалуйста, как можно избавиться от пятна РНК в плазмидной ДНК , выделенной вручную? я хочу ее далее секвенировать.

А она по идее сильно мешать недолжна.
А так обработать РНКазой только без фанатизма достаточно 10-30мкг/мл, а потом фенолить, но от фенол надо хорошо избавится переосаждением спиртом и спирт-эфиром.

Можно еще осадить РНКу 6М LiCl. Но это малоэфективно.
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 22.04.2008 20:13     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #62 множественное цитирование

(Anna_K213 @ 22.04.2008 12:46)
Ссылка на исходное сообщение  Скажите, пожалуйста, как можно избавиться от пятна РНК в плазмидной ДНК , выделенной вручную? я хочу ее далее секвенировать.

В более продвинутых протоколах (китах) РНК-аза используется до начала лизиса клеток. Так что возвращайтесь на исходные позиции, а готовую плазмиду освобождать от РНК-аз - дороже обойдется. Если это пятно не такое яркое, не обращайте внимание и секвенируйте - авось обойдется. smile.gif
Гость
IP-штамп: frdk4fFh7od4A
гость



 прочитанное сообщение 25.07.2008 04:47     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #63 множественное цитирование

добавляю РНКазу между 1 и 2 растворами, держу 15 минут на 37С. Все работает
Участник оффлайн! Lexey

Харьков



 прочитанное сообщение 28.07.2008 12:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #64 множественное цитирование

1) Кто нибудь пробовал эту методу для выделения плазмидного профиля из диких штамов? Если есть опыт, поделитесь! Необходимость только в форезе.
2) Теоретический. Откуда такая разница в концентрации плазмид, когда вместо LB используется МПА?
Участник оффлайн! викки




 прочитанное сообщение 10.09.2008 20:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #65 множественное цитирование

Товарищи!
Кто может подсказать почему TE буфер при выделении плазмиды мелодом щелочного лизиса дожен быть с рН именно 8.0?????
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 11.09.2008 12:09     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #66 множественное цитирование

(викки @ 10.09.2008 19:29)
Ссылка на исходное сообщение  Товарищи!
Кто может подсказать почему TE буфер при выделении плазмиды мелодом щелочного лизиса дожен быть с рН именно 8.0?????

Независимо от метода, ТЕ всегда рН 8.0. Можно конечно с 8.5 и даже 9.0, но никак не меньше 8.0. и от метода выделения это не зависит.
Кстати, сейчас весь мир использует только метод щелочного лизиса, а другие остались в 20 веке.
Участник оффлайн! викки




 прочитанное сообщение 11.09.2008 20:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #67 множественное цитирование

упс... немного некорректно выразилась... я имела ввиду, как именно это значение рН влияет на дальнейший ход работы... ????? сам TE используется как хелатирующий агент... перед детергентом(SDS)...это понятно... но ПОЧЕМУ именно 8.0? какую роль играет это значение?
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 11.09.2008 21:57     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #68 множественное цитирование

(викки @ 11.09.2008 19:47)
Ссылка на исходное сообщение  упс... немного некорректно выразилась... я имела ввиду, как именно это значение рН влияет на дальнейший ход работы... ?????    сам TE используется как хелатирующий агент... перед детергентом(SDS)...это понятно... но ПОЧЕМУ именно 8.0? какую роль играет это значение?

Никакой. Мелочи в жизни. Для сведения, при понижении рН ниже 8 ЭДТА начинает потихоньку выпадать в осадок или по-другому, при рН ниже 8 ЭДТА не растворяется в воде. smile.gif
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=265077
Участник оффлайн! PPK Rattus




 прочитанное сообщение 06.06.2009 22:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #69 множественное цитирование

(Lexey @ 28.07.2008 15:13)
Ссылка на исходное сообщение  1) Кто нибудь пробовал эту методу для выделения плазмидного профиля из диких штамов? Если есть опыт, поделитесь! Необходимость только в форезе.
У меня точно такая же задача стояла (см. выше). Полный алгоритм выделения, с щелочным лизисом и осаждением спиртом я пока оставил, поскольку он оказался весьма требовательным к чистоте реактивов.
Взял поэтому за основу экспресс-метод http://molbiol.ru/protocol/04_03.html в модификации DNAuser с некоторыми уточнениями:
1. Ресуспендируем в 60 мкл. TE
2. Фенол-хлороформим дважды, потом хлороформим однократно (правда работает это вроде как только на Грам- бактериях: из лизирующих компонентов, как я понял, там только фенол и для толстого пептидогликана Гр+ его, по-видимому, недостаточно).
3. Полученный раствор (~45мкл) + 2 капли минерального масла (чтобы не испарился) прогреваем при 90°С ~4мин. и плавно остужаем (можно в руках) для ренатурации pDNA (иначе на форезе плазмида в виде разных конформаций пойдет несколькими полосами и не там, где надо)
4. Собираем 35-40мкл. из мод масла и хорошо смешиваем в новой пробирке с 5-6мкл. 1x буфера для внесения.
5. Вносим в лунки 0,8-0,9% геля и форезим 2ч. при 5в/см в 1x TBE буфере (гель нужен достаточно длинный).

Выход, конечно, по меркам здешних суровых хтонических молбиологов будет дико слабый и грязный, но для фореза - достаточно.

(Lexey @ 28.07.2008 15:13)
2) Теоретический. Откуда такая разница в концентрации плазмид, когда вместо LB используется МПА?
В принципе можно и на том и на другом - и так и так выход есть видимый. Где больше, где меньше пока не замечал.
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  29.12.2021 17:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #70 множественное цитирование

https://replicawatches24.tumblr.com/post/64...lica-watches-uk
https://ello.co/replicawatchesuk/post/ubut9ig9g4glx-q6nyphka
https://www.evernote.com/shard/s451/client/...%2BWatches%2BUK
https://www.bloglovin.com/@rolexrelicawatch...replica-watches
https://www.designspiration.com/watcheshutuk/saves/
https://write.as/fakerolexwatches/hints-to-...lica-watches-uk
https://www.dailystrength.org/journals/hint...lica-watches-uk
https://issuu.com/replicawatchesuk/docs/dif...he_replica_watc
https://www.keepandshare.com/discuss2/5601/...lica-watches-uk
https://penzu.com/public/9e250377
https://bestreplicawatc.livejournal.com/336.html
https://www.pearltrees.com/replicawatchesuk/item349627941
https://www.intensedebate.com/people/watches24
https://anonfiles.com/N039Qf66q9/Guide_On_H...atch_Online_pdf

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 09:58
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft