Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Из ваших докладов не ясно, работают ли первые антитела на GAPDH в доте, по сравнению с чем чувствительность меньше. Как вы делали дот на GAPDH, что было материалом для пробы, какой раствор использовали для нанесения на мембрану материала. Одно очевидно, после экстрагирования антитела фермент не видят, вот вам и ответ - меняйте первые антитела. Они у вас кстати поли- или моноклоны и от какой фирмы. Но есть нюансы например, когда вы делали дот, раствор для нанесения не позволил связаться GAPDH с мембраной или экстрагирующий буфер разрушает АГ-детерминанту GAPDH, но понять это из ваших докладов не возможно. Возможно, что фирма не виновата, особенно если это моноклоны, ибо моноклоны часто не узнают белка на блоте после денатурации на форезе или при экстракции. -- а вот как с точностью, А если подумать? |
Гость IP-штамп: frpSEtPSk3fY. гость |
В следующем опыте я нанесла экстрагированный белок на блот - максимальная концентрация - 250 нано грамм , раствор для отмывки тотже: трис, NaCl,твин 20 - 0,3%.затем нанесла антитела первые - GAPDH в той концентрации, в которой они работали на дот блот,затем вторые, и не получила никакого ответа. Возможно белок денатурирован. Спасибо за коментарии и вторые антитеда |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Если Моноклоны есть вероятность, что они в вестерне не работают. Надо запросить Санта Кроуз по этому поводу. --в доте первые антитела на GAPDH работают, но картинку я получила инвертированную. места нанесения GAPDH светлые, весь блот черный. Буфер для отмывки антител - трис, NaCl,твин 20 0,3. Это как раз больше похоже не на работу, а на отсутствие забивки и неработающие антитела. При чем если раствор, в котором вы наносили пробу с GAPDH на дот, близок физиологическому, то похоже что эти антитела не будут работать и в имуноприципитации и почти верняк не будут работать в ИФА. Собирайте результаты и шлите рекламации санте. |
Glebber Постоянный участник London, UK |
(Гость @ 25.04.2007 14:35) Антитела на GAPDH - monocloni Санта Круз, в доте первые антитела на GAPDH работают, но картинку я получила инвертированную. места нанесения GAPDH светлые, весь блот черный. Буфер для отмывки антител - трис, NaCl,твин 20 0,3. Q. Why do I get a negative image on my Western blots? The bands are either white, clear or outlined in black with a low to moderate gray background across the blot. A. Excess reporter enzyme (horseradish peroxidase) in a small area can rapidly exhaust its substrate in the short time it takes to move the membrane from the detection reagents to film (or a CCD camera or scanner). You may be able to visualize your bands by returning the membrane to the detection reagent solutions for 5 – 10 minutes and then repeating the detection. The long-term solution is to reduce the secondary antibody dilution (or whichever antibody is conjugated to the reporter enzyme) or to load less protein onto the gel, thereby decreasing the amount of target. Click here for more information about Western Blotting |
Ольга Л. |
mesentsev Постоянный участник 17.05.2006 18:24 URL #23 -------------------------------------------------------------------------------- Например, для goat anti-rabbit поизводства Jackson Immunoresearch (Cat# 111-035-003) подходит 0.5% Carnation Instant Nonfat Dry milk fortified with vitamins A & D. Не самое лучшее молоко, но в отличие от того что продает Fisher или Bio-Rad оно раз в пять или шесть, по-моему, дешевле и вполне работоспособно, если его фильтрануть через бумажный фильтр. Подскажите, пожалуйста, а где вы покупаете это молоко Carnation? Если Вы в России, конечно. И какое еще сухое молоко можно использовать, чтобы было дешево и сердито? Заранее спасибо! |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
А так любое сухое молко в котором содержание жира на сухой вес не превышает 2.5%. В Рассейских Гостах такое молоко должно встречаться, его технологи еще называют сухой обрат. Импортное молко для культуристок и др. фитнес-телок бывает с содержанием жира 0.5% - это ваще супер и растворяется хорошо. Рассейское обычно продают на каких-нибудь пищевых развалах в ларьках, фасованное в ПЭ мешки в ручную. Из-за истекшего срока хранения или неправильного хранения может быть прокисшим. Так что рекомендую его пробовать, прежде чем покупать и растворяется оно хуже чем иноземное. Еще рассеское можно пошукать по пищевым(кондитерские фабрики, фабрики мороженного,майонезные производства итд) и молочным комбинатам, если знакомые там работают - можно спросить.
|
Гость IP-штамп: frOPgq3SsgFsA гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
Гость IP-штамп: frwHCzM7irGkI гость |
Првый раз ставлю блоттинг, на оборудовании Bio-Rad. Маленький белок, 10кДа. Есть какие-то особенности, подводные камни. Может кто знает? Наталья |
guest: Гость IP-штамп: frtqj.kwixseM гость |
|
Guest IP-штамп: fr0CXODQM332o гость |
На что блотить будете (PVDF, нитроцеллюлоза)? |
Гость IP-штамп: frwHCzM7irGkI гость |
|
Guest IP-штамп: fr0CXODQM332o гость |
если вы первый раз ставите блоттинг, то прочитайте это (думаю, у вас эта камера. или другая?) конечно, до покрытия рамок. зачем сухой перенос? |
Guest IP-штамп: fr0CXODQM332o гость |
www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf |
Era2007 |
Уважаемые форумчане, ответьте мне, пожалуйста, на такой вопрос: какой эндогенный контроль лучше использовать при детекции уровня экспрессии белков, скажем, у больных и у здоровых индивидов? И нужен ли такой контроль? Заранее спасибо за ответ. |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Можете вырвнивать по гистонам(если найдете к ним антитела), по GAPDH, по актину. Все еще зависит от того какая ткань, сколько и какого в ней ВКМ, какое отношение объема цитоплазмы к ядру и тд итп. Какой белок ядерный, цитоплазматический, внеклеточнный. Проще всего почитать статьи про данный конкретный белок и его уровень и способы его измерения. Там можно найти много полезного. |
Гость IP-штамп: frYFKPXNgytn6 гость |
Может кто-нибудь об этом тоже что-то слышал и подскажет, где искать? Спасибо! |
Guest IP-штамп: frd2SkIM.hhaA гость |
|
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
|
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
|
Ale-x Постоянный участник |
(akimovster @ 11.07.2008 09:09) Этанол, 40%, и БСА. |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Ale-x Постоянный участник |
(guest: ммм @ 11.07.2008 12:49) Да, коктейль "White Russian" и лимонное желе на закусь |
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
БСА в какой коцентрации? и Вчём растворять? |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
А молоко в чем растворяете? |
Гость IP-штамп: frr9CTKwsZV0s гость |
|
Guest IP-штамп: frZTsnoh7XPl6 гость |
|
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
|
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
Кто проверял? Этанол точно работает в 40% концентрации? |
Ale-x Постоянный участник |
(akimovster @ 23.07.2008 06:00) Всю жизнь так работаю. |
Ale-x Постоянный участник |
(akimovster @ 14.07.2008 10:06) БСА - в TBS или PBS, лучше с твином |
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
То есть, мембрану предварительно вымачиваем в этаноле, затем уравновешиваем бубером для переноса, содержащим этанол 40%? А почему так много этанола, может стоит 10%? Не будет ли проводимость буфера страдать? |
Ale-x Постоянный участник |
(akimovster @ 24.07.2008 07:35) "Этанол точно работает в 40% концентрации. Всю жизнь так работаю." То есть, мембрану предварительно вымачиваем в этаноле, затем уравновешиваем бубером для переноса, содержащим этанол 40%? А почему так много этанола, может стоит 10%? Не будет ли проводимость буфера страдать? Ничего не страдает, почему 40% - не знаю, люди добрые подсказали, сам не проверял. Наверное, менделеевка все-таки правильнее разведена. Мембрану вымачиваю в воде и буфером не заморачиваюсь, но думаю, что хуже не будет. |
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
А есть разница, какую мембрану использовать? У меня PVDF. Для неё тоже 40% этанол? |
Guest IP-штамп: frANMBFdTSq1Q гость |
|
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
" Спасибо Вам!!! |
Pavel2 Участник |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Есть, но ими никто не пользуется. Хорошо идут квадратные чашки петри, круглые тоже не плохо, коробочки из под китов, коробочки из под канцелярских скрепок и бижутерии, коробочки из под предметных стекл. А так качалка любая например от биосана или элми. Так же самодельные качалки из моторчика от КиПА( КСП(потенциометр) КСМ(мост) есть такие промышленные измерительные приборы с самописцем на ЩУПы ставят) вот этот моторчик на него(в смысле наего вал) одевается диск, который служит приводом шатуну, который качает пластину закрепленную грубо говоря как крышка на петлях. У таких качалок есть одно преимущество: они могут работать без остановки месяцами, при температуре от минус 10, до плюс 50. А недостатки невозможность регулировать обороты и большой шум(механический редуктор). |
Pavel2 Участник |
Если использовать чашку петри или какую нибудь коробочку, то расход реактивов и сыворотки будет очень большим. Для IgG-иммуноблота необходимо разводить сыворотку 1:2, если мы будем использовать пластик с емкостью даже 5 мл расход сыворотки будет очень большой. А для IgE-иммуноблота разводить сыворотку и конъюгат нужно еще меньше. |
Guest IP-штамп: fr.qBeWWz8.0E гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Если б я не знал обстоятельств нашей жизни, я бы посоветовал вам с такими реактивами не работать. А купить или получить нечто более адекватное. Коньюгатов с таким разведением не бывает их просто никто не будет покупать. Сыворотки, конечно разные бывают, но все же. Такую сыворотку можно вобще не разводить, а за-азидить 0.1% азидом и пользоваться(многократно) до тех пор пока не истощится. А еще мембрану можно порезать на дорожки из дорожек вырезать нужное место мол веса по маркеру и по пять десять штук в 24 луночном планшете клеточном качать. Или по 2-3 стрипа в фэлконовской 15 мл пробирке на ролере там мл жидкости доложно хватитть на покрытие. Если у вас несколько дорожек с одним антигеном вырезается узкий стрип по мол весу поперек дорожек и в тот же фэлкон. Короче голь на выдумки хитра. |
светлана гырылова |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Высокопроцентную агарозу можно получить только в автоклаве. |
Гость IP-штамп: frxTVV0Pgb/I2 гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Гость IP-штамп: frxTVV0Pgb/I2 гость |
|
Асель Биктасова |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
PS Возможно что-то поменялось в субстратном буфере что мешает ТМБ иммобилизоваться на мембране. Если ничего не менялось, все вопросы к производителю или просто поменять ТМБ на новый. |
Асель Биктасова |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |