Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Guest IP-штамп: frTlWdNmzlEpc гость |
|
Horse-radish Участник |
Это связанно только с низкой концентрацией лигазы или есть еще причины? |
Гость IP-штамп: frsOY1KArVVno гость |
|
GuestB IP-штамп: frTITTs62W.JQ гость |
Я лигирую кассету, затем лигирую ее в плазмиду. Можно проверить форезом? Или целесообразние ставить сразу второе лигирование, трансформировать и смотреть результат? |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Возможно(как один из вариантов) плохие липкие концы, если вы по ним лигируете. Те старый ПЦР или плохие рестриктазы. |
25,65 ЕUR IP-штамп: frCCxagoxzeik гость |
Использование слишком низких концентраций чего, вектора? Заранее спасибо за ответ. |
путьведев IP-штамп: frCCxagoxzeik гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Это ж очевидно вытекает из закона действия масс. А второй ник страшен тем, что похож на спамбота. |
спамбот IP-штамп: frCCxagoxzeik гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Это написано не для дефосфорилированного вектора. Дальше что. Да, лигирование один из самых капризных шагов в клонировании и часто похож на алхимию. Чего вы хотите. Эксперементируйте думайте и проверяйте все ваши реактивы в контрольных экспериментах. Главное не пытаться быстро и малой кровью получить результат за деньги или из какого-то волшебного протокола. |
comp3v Постоянный участник Москва |
(спамбот @ 24.03.2009 19:52) Я после нескольиких неудачных раундов лигирования уже в свою догадливость не верю. Очевидно, дефосфорилированный вектор самолигироваться не может. Конкатомер как я себе представляю образуется по схеме вектор-вставка-вектор-...-вставка-вектор-вставка (если разные сайты рестрикции). Чем больше /С/ вектора тем больше молекул конкурируют за свободый конец вставки. Так же вроде? вы, если хотите совета - лучше напишите сюда конкретно ваши условия реакции и сколько чего берёте - глядишь, и порекомендуют чего как улучшить. |
спамбот IP-штамп: frCCxagoxzeik гость |
Блин... А ведь я судя по всему туплю - зачем я дефосфорилирую вектор, резаный по разным сайтам? Не пытаюсь, денег нет, в волшебные протоколы не верю. Спасибо. 2 comp3v Думаю условия много света не прольют. Вот они: вектор pEGFP-C3, вставка 1кb, XhoI Sal I. Протокол: рестрикция, дефосфорилирование вектора (я выше написал, видимо это необязательно), очистка на форезе, лигирование Fast T4 DNA ligase (Fermentas) 1час, 2 мкл лигазной смеси для трансформации, штамм ХL-1 |
comp3v Постоянный участник Москва |
(спамбот @ 24.03.2009 20:41) 2 comp3v Думаю условия много света не прольют. Вот они: вектор pEGFP-C3, вставка 1кb, XhoI Sal I. Протокол: рестрикция, дефосфорилирование вектора (я выше написал, видимо это необязательно), очистка на форезе, лигирование Fast T4 DNA ligase (Fermentas) 1час, 2 мкл лигазной смеси для трансформации, штамм ХL-1 Это ещё не протокол. Напишите, сколько чего берёте на лигирование - сколько вектора, сколько вставки, сколько лигазы.
|
Guest IP-штамп: frD427Oiso1go гость |
|
Guest IP-штамп: frD427Oiso1go гость |
|
guest: 1 IP-штамп: frCCxagoxzeik гость |
Моя коллега так и делает - лигирует в pJet по тупым концам, потом режет и потом лигирует в pGFP Я решил время сэкономить. Ну и по моим представлениям все должно получаться и с пцр-продуктом. |
e.coli Участник The Сатанів |
Отсюда: По крайней мере частичное объяснение. |
Guest IP-штамп: frD427Oiso1go гость |
(guest: 1 @ 25.03.2009 11:38) Спасибо Guest. C этой фаст-лигазой, вообще что-то странное, имхо. После неудачной трансформации, разогнал лигазную смесь на форезе - намного ниже 10 000 жирная полоса, и слаааабый шмер по всему интервалу вплоть до 1000 где-то. Я не очень понимаю как это интерпретировать. Моя коллега так и делает - лигирует в pJet по тупым концам, потом режет и потом лигирует в pGFP Я решил время сэкономить. Ну и по моим представлениям все должно получаться и с пцр-продуктом. ну это оно должно. Но часто не работает. Насчёт лигаз - я пользуюсь промеговской лигазой в fast ligation буфере (2х который), но ставлю не на два часа, а на ночь или часов на 6. Всё лигируется. |
guest: 1 IP-штамп: frCCxagoxzeik гость |
|
Guest IP-штамп: frD427Oiso1go гость |
|
Miss Marple Участник Москва vs. Европа |
После лигирования получили 1-2 колонии на чашку - что есть мало. Пожалуйста, подскажите, что не так. (Пропись использовали и раньше с другой линейной ДНК, получали в среднем 20 колоний на чашку.) ПЦР-или плазмиду 5,5кб, убирая её "кусок" ПЦРом. На 5прайм конце праймеров - половинки добавочного сайта рестрикции. Судя по гелю, выход продукта ПЦР где-то 1 микрограмм. После очистки - 40нг/мкл. Phosphorilation: 30mkl DNA (40ng/mkl, purified from gel PCR product of full lenth plasmid) 1,5mkl 50mM ATP 1mkl PNK Fermentas 3,6mkl PNK buffer A 90'37C 10'70C Ligation: 1mkl T4 DNA Ligase (NEB) 5mkl T4 ligase buffer 5mkl PEG 4000 50% 16mkl linear phosphorilated DNA 23mkl H2O 1h room temperature Transformation DH5alfa Трансформируется вся лигазная смесь полностью. Потом все полностью расторается по чашке. Есть подозрение, что фосфатаза не сработала. Как проверить, какие контроли поставить? |
guest: ммм IP-штамп: frCNCa5alkkCM гость |
Есть подозрения что не очень эффективная трансформация или лигирование. |
Miss Marple Участник Москва vs. Европа |
(guest: ммм @ 24.09.2009 07:56) Трнасформация стандартная, как всегда (30 минут на льду без теплового шока), клетки высококомпетентные - 50нг контрольной плазмиды дают 30-50 колоний на чашку (по-другому компетентность не проверялась и не пассчитывалась). Пробовала вчера ставить лигирование по-другому: 12 мкл Вода 5мкл фрагмент ДНК 35нг/мкл (фосфорилировала более свежей фосфокиназой) 2мкл Буфер 1мкл фермент (НЕБ) В 20мкл, 2 часа на столе - как указано в брошюре для фермента (также без добавления ПЕГ). Итог - ноль колоний. |
guest: ммм IP-штамп: frCNCa5alkkCM гость |
Вы этот +контроль, вчера ставили? Я ничего не могу вам сказать. только вы почему то очень свято верите в то что у вас все работает. А проверкой этого не занимаетесь. |
Miss Marple Участник Москва vs. Европа |
(guest: ммм @ 24.09.2009 12:03) Вы этот +контроль, вчера ставили? Я ничего не могу вам сказать. только вы почему то очень свято верите в то что у вас все работает. А проверкой этого не занимаетесь. 50 нг плазмиды как положительный контроль - дали (не считала), но на глаз - где-то под сотню колоний. Контроли без лигирования тоже ставлю: 100нг линейной фосфорилированной ДНКи (ноль колоний, в том числе когда при лигировании было 1-2 колонии на чашку). Что еще не учла? какие еще контроли? |
Miss Marple Участник Москва vs. Европа |
(guest: ммм @ 24.09.2009 12:03) Вы этот +контроль, вчера ставили? Я ничего не могу вам сказать. только вы почему то очень свято верите в то что у вас все работает. А проверкой этого не занимаетесь. Просто в качестве апдейта: Коснструкт "сработал" из одного клона и был пущен на дальнейшее клонирование вставки по двум сайтам рестрикции. На рестрикцию было взято 3мкг плазмиды, но на этот раз фрагмент вырезался под 366нм УФ, а фотографировались "дырки" на геле. Продукт элюировлся в 30мкл буфера и 10мкл было взято на лигирование. Итог - несколько сотен колоний на чашку. Практика фотографирования "дырок" взята на заметку.... |
Guest IP-штамп: frMsTDflcGfck гость |
плазмиды 3-15 кб. |
RJ Dio Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frDQwa9k7riYg гость |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
nifloW |
ПЦР продукт 955 п.о. выделен электрофорезом, почищен нашим набором "БиоСилика" Лигирую в pGEM-Tvectot или Т-easy ON во льду в соотношении 1:1,5 2х буфер 5мкл лигаза 1мкл вектор 0,6мкл вставка 2мкл вода 1,4мкл Электропорация 2мкл лигазной смеси в 60 мкл комп. клеток (10^8 на pUC19)DH5alpha импульс 5мс (1.8кВ, 1мм кюветы) хот.шок 47С в LB бульон (МgCl2,Glc) инкубация на 37С 1 час Рассев 200мкл на чашку LB агар 2% (Amp200, X-Gal, IPTG) 37С ON |
RJ Dio Постоянный участник |
|
protein Постоянный участник Magyarország |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
protein Постоянный участник Magyarország |
(nifloW @ 09.03.2010 14:02) и соотношение подправьте, сделайте 1:3-5 |
RJ Dio Постоянный участник |
|
nifloW |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
nifloW |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
nifloW |
Проверила с другой лигазой. Поставила ПЦР+форез SP6 1.9 T7 2 dNTP 0.8 MgCl2 2 TagPol 0.7 C1 буфер 2 H2O 8.6 2мкл лигазной смеси 1. 94с 1мин30 2. 94с 25сек 60С 15с 72С 1м40 3. 72С 4м 4. 4С в 1% агарозе Итог - дорожки пусты, только маркер. Ставила с новой лигазой, не из наборов для вектора, как со старым буфером так и с новым, с ATP и без (того 4 дорожки не считая контроля и маркера). Ранее так же гоняла два набора векторов с их лигазами (+ доп контроли без лигаз) - дорожки пусты. Сообщение было отредактировано nifloW - 12.03.2010 07:24 |
RJ Dio Постоянный участник |
|
nifloW |
Спасибо за советы! |
RJ Dio Постоянный участник |
|
nifloW |
|
RJ Dio Постоянный участник |
|
nifloW |
|
velekap |
|
Epsilon Новосибирск |
|
R.J.Dio Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |