Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
D evgenii Постоянный участник Томск |
|
natamat |
|
Yuliya Khrunyk Екатеринбург |
|
Guest IP-штамп: frxAsb7GYr/9c гость |
Дело в том, что имеется с десяток праймеров к кДНК одного гена ("садятся" на кДНК, ожидаемая длина продуктов от 1000 до 1600bp). Перепробовали различное сочетание концентраций Mg, dNTP, полимеразы, "сажали" праймеры на градиенте темеператур - результат - или полное отсутствие всякого присутствия, или масса неспецифики до 700bp, или шмеры от лунки (ближе к лунке ярче шмер). Может проблема в ингибировании ПЦР компонентами обратной транскрипции? Хотя выделение ДНК из RT-смеси с помощью колонок и glass milk не помогло (картина не отличалась от контрольных неочищенных образцов). Хелп |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 01.04.2009 10:05) Подскажите, пожалуйста, есть ли какие то особенности амплификации кДНК. Дело в том, что имеется с десяток праймеров к кДНК одного гена ("садятся" на кДНК, ожидаемая длина продуктов от 1000 до 1600bp). Перепробовали различное сочетание концентраций Mg, dNTP, полимеразы, "сажали" праймеры на градиенте темеператур - результат - или полное отсутствие всякого присутствия, или масса неспецифики до 700bp, или шмеры от лунки (ближе к лунке ярче шмер). Может проблема в ингибировании ПЦР компонентами обратной транскрипции? Хотя выделение ДНК из RT-смеси с помощью колонок и glass milk не помогло (картина не отличалась от контрольных неочищенных образцов). Хелп Возможно у вас дело до ПЦР не доходит, т.е. не идет обратная транскрипция нет в ПЦР кДНК. Нужно иметь под рукой всегда и на все контроли, контроли, контроли, контроли.... |
Guest IP-штамп: frxAsb7GYr/9c гость |
(Ъ @ 01.04.2009 11:33) Возможно у вас дело до ПЦР не доходит, т.е. не идет обратная транскрипция нет в ПЦР кДНК. Нужно иметь под рукой всегда и на все контроли, контроли, контроли, контроли.... Спасибо за столь быстрый ответ Дело в том, что эта же кДНК используется для постановки real-time PCR с TaqMan-зондами и там все ОК - кДНК искомого гена присутствует, амплифицируем же (точнее пытаемся) более длинный участок для последующего секвенирования. Может ли быть, что при очиске продуктов обр. транскрипции (колонки, силикатные частицы) вместе с кДНК остается значительное кол-во РНК которая и ингибирует амплификацию более длинных фрагментов или это ерунда? Я не молекулярный биолог, потому могу ляпнуть что-нибудь смешное |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
Попробуйте без очистки кДНК, но добавьте ОТ смесь к ПЦР в количестве 10-20%. Но обязательное ингибирование ревертазы - 70-80 оС 10-15 мин. При очистки мизерных количеств возможны 100% потери |
Guest IP-штамп: fr8fpjHnS0vCc гость |
(Guest @ 01.04.2009 10:05) Подскажите, пожалуйста, есть ли какие то особенности амплификации кДНК. Дело в том, что имеется с десяток праймеров к кДНК одного гена ("садятся" на кДНК, ожидаемая длина продуктов от 1000 до 1600бп). Перепробовали различное сочетание концентраций Мг, дНТП, полимеразы, "сажали" праймеры на градиенте темеператур - результат - или полное отсутствие всякого присутствия, или масса неспецифики до 700бп, или шмеры от лунки (ближе к лунке ярче шмер). Может проблема в ингибировании ПЦР компонентами обратной транскрипции? Хотя выделение ДНК из РТ-смеси с помощью колонок и гласс милк не помогло (картина не отличалась от контрольных неочищенных образцов). Хелп "Суперскрипту 3" возмите Инвитрогеновскую протянет вам кДНК в 11000 при 60 градусов ну а потом и пцрте |
Гость IP-штамп: frxAsb7GYr/9c гость |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
|
Гость IP-штамп: frxAsb7GYr/9c гость |
|
Гость IP-штамп: frxAsb7GYr/9c гость |
|
Guest IP-штамп: fr8fpjHnS0vCc гость |
(Гость @ 10.04.2009 11:12) Начинать нужно с заучивания статьи Инниса и Гельфанда "Оптимизация ПЦР реакций" и повторять вслух утром и вечером , как "Отче наш" Innis MA and Gelfand DH (1990). Optimization of PCRs. pp. 3-12 in: PCR Protocols |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Гость @ 10.04.2009 10:24) Вопрос от чайника. Сколько нужно взять праймера концентрацией 88 pmol/mkl, молярная масса 5530, чтобы финальная концентрация в 20 мкл была от 0,1 до 0,5 мкМ 88 pmol/mkl - надеюсь это выражение концентрации вы понимаете. А вот 0,1 до 0,5 мкМ означает микромоли праймера в ЛИТРОВОМ объеме (большая буква М в мкМ на это указывает). Осталось пересчитать на ваши 20 мкл. |
Vovka Genetik |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Vovka Genetik @ 22.04.2009 20:07) [Подскажите, какие праймеры используют для ПЦР на объекте Linum ucitatissimum (лен). Заранее благодарен] В переводе на русский: Доктор, ... у меня ... э-это... |
achiffa Участник |
Вопрос такой: для обратной траскрипции и амплификации кДНК в одной пробирке (1 step RT-PCR) можно использовать смесь dNTP с dTTP? А то вот этой инструкции Applied Biosystems предлагает почему-то dUTP вместо dTTP. |
Alex2006 Постоянный участник Берлин |
|
achiffa Участник |
|
Alex2006 Постоянный участник Берлин |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(achiffa @ 08.07.2014 14:45) Здравствуйте! Вопрос такой: для обратной траскрипции и амплификации кДНК в одной пробирке (1 step RT-PCR) можно использовать смесь dNTP с dTTP? А то вот этой инструкции Applied Biosystems предлагает почему-то dUTP вместо dTTP. Значит, эту инструкцию читали невнимательно. Там есть ссылка на эту классику. (к сожалению у меня нет фултекста). Для расширения кругозора можете почитать: На коротких GC-богатых ампликонах можно проколоться - основной недостаток UNG. |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |