Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Состав PCR реакции -- comments to a permanent page of the site --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Тема связана с: Компоненты PCR смеси
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! D evgenii
Постоянный участник
Томск



 прочитанное сообщение 04.03.2009 08:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #51 множественное цитирование

Можно пробирки с праймерами бросить в кипящую воду или нагреть при 99С на термостате (тоже помогало), минут 5-10 подержать. Затем или в лед, или в снег... Т.е. хорошо охладить, и продолжать юзать...
Участник оффлайн! natamat




 прочитанное сообщение 11.03.2009 08:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #52 множественное цитирование

скажите, кто-нить что-нить слышал про ацетатный буффер для ПЦР, не для фореза - это ясно как божий день, а именно для ПЦР?
Участник оффлайн! Yuliya Khrunyk

Екатеринбург



 прочитанное сообщение 14.03.2009 16:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #53 множественное цитирование

поставь в эпендорфах в термоблок на 99 градусов на две минуты, и потом - сразу на лед. Если есть возможность, делай gradient PCR
Guest
IP-штамп: frxAsb7GYr/9c
гость



 прочитанное сообщение 01.04.2009 11:05     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #54 множественное цитирование

Подскажите, пожалуйста, есть ли какие то особенности амплификации кДНК.
Дело в том, что имеется с десяток праймеров к кДНК одного гена ("садятся" на кДНК, ожидаемая длина продуктов от 1000 до 1600bp).
Перепробовали различное сочетание концентраций Mg, dNTP, полимеразы, "сажали" праймеры на градиенте темеператур - результат - или полное отсутствие всякого присутствия, или масса неспецифики до 700bp, или шмеры от лунки (ближе к лунке ярче шмер). Может проблема в ингибировании ПЦР компонентами обратной транскрипции? Хотя выделение ДНК из RT-смеси с помощью колонок и glass milk не помогло (картина не отличалась от контрольных неочищенных образцов). Хелп frown.gif
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 01.04.2009 12:33     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #55 множественное цитирование

(Guest @ 01.04.2009 10:05)
Ссылка на исходное сообщение  Подскажите, пожалуйста, есть ли какие то особенности амплификации кДНК.
Дело в том, что имеется с десяток праймеров к кДНК одного гена ("садятся" на кДНК, ожидаемая длина продуктов от 1000 до 1600bp).
Перепробовали различное сочетание концентраций Mg, dNTP, полимеразы, "сажали" праймеры на градиенте темеператур - результат - или полное отсутствие всякого присутствия, или масса неспецифики до 700bp, или шмеры от лунки (ближе к лунке ярче шмер). Может проблема в ингибировании ПЦР компонентами обратной транскрипции? Хотя выделение ДНК из RT-смеси с помощью колонок и glass milk не помогло (картина не отличалась от контрольных неочищенных образцов). Хелп frown.gif

Возможно у вас дело до ПЦР не доходит, т.е. не идет обратная транскрипция нет в ПЦР кДНК.
Нужно иметь под рукой всегда и на все контроли, контроли, контроли, контроли....
Guest
IP-штамп: frxAsb7GYr/9c
гость



 прочитанное сообщение 01.04.2009 13:07     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #56 множественное цитирование

(Ъ @ 01.04.2009 11:33)
Ссылка на исходное сообщение  Возможно у вас дело до ПЦР не доходит, т.е. не идет обратная транскрипция нет в ПЦР кДНК.
Нужно иметь под рукой всегда и на все контроли, контроли, контроли, контроли....

Спасибо за столь быстрый ответ smile.gif
Дело в том, что эта же кДНК используется для постановки real-time PCR с TaqMan-зондами и там все ОК - кДНК искомого гена присутствует, амплифицируем же (точнее пытаемся) более длинный участок для последующего секвенирования.
Может ли быть, что при очиске продуктов обр. транскрипции (колонки, силикатные частицы) вместе с кДНК остается значительное кол-во РНК которая и ингибирует амплификацию более длинных фрагментов или это ерунда?
Я не молекулярный биолог, потому могу ляпнуть что-нибудь смешное smile.gif
teapot.gif
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 01.04.2009 13:59     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #57 множественное цитирование

ОТ конечно может ингибировать ПЦР. но не настолько же. confused.gif
http://genome.cshlp.org/content/4/1/62.full.pdf
http://nar.oxfordjournals.org/cgi/reprint/33/20/e181.pdf
Попробуйте без очистки кДНК, но добавьте ОТ смесь к ПЦР в количестве 10-20%. Но обязательное ингибирование ревертазы - 70-80 оС 10-15 мин.
При очистки мизерных количеств возможны 100% потери umnik.gif
Guest
IP-штамп: fr8fpjHnS0vCc
гость



 прочитанное сообщение 02.04.2009 01:45     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #58 множественное цитирование

(Guest @ 01.04.2009 10:05)
Ссылка на исходное сообщение  Подскажите, пожалуйста, есть ли какие то особенности амплификации кДНК.
Дело в том, что имеется с десяток праймеров к кДНК одного гена ("садятся" на кДНК, ожидаемая длина продуктов от 1000 до 1600бп).
Перепробовали различное сочетание концентраций Мг, дНТП, полимеразы, "сажали" праймеры на градиенте темеператур - результат - или полное отсутствие всякого присутствия, или масса неспецифики до 700бп, или шмеры от лунки (ближе к лунке ярче шмер). Может проблема в ингибировании ПЦР компонентами обратной транскрипции? Хотя выделение ДНК из РТ-смеси с помощью колонок и гласс милк не помогло (картина не отличалась от контрольных неочищенных образцов). Хелп frown.gif


"Суперскрипту 3" возмите Инвитрогеновскую протянет вам кДНК в 11000 при 60 градусов ну а
потом и пцрте
Гость
IP-штамп: frxAsb7GYr/9c
гость



 прочитанное сообщение 10.04.2009 09:24     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #59 множественное цитирование

Вопрос от чайника. Сколько нужно взять праймера концентрацией 88 pmol/mkl, молярная масса 5530, чтобы финальная концентрация в 20 мкл была от 0,1 до 0,5 мкМ
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 10.04.2009 10:00     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #60 множественное цитирование

А проблема в чем? Не знаете мол.массу одного нуклеотида или ... нет калькулятора? confused.gif
Гость
IP-штамп: frxAsb7GYr/9c
гость



 прочитанное сообщение 10.04.2009 10:11     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #61 множественное цитирование

Проблема в том, что нет знаний... Все остальное есть . Просто я никогда этим не занимался
Гость
IP-штамп: frxAsb7GYr/9c
гость



 прочитанное сообщение 10.04.2009 10:12     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #62 множественное цитирование

Проблема в отсутствии нужных знаний... Все остальное есть
Guest
IP-штамп: fr8fpjHnS0vCc
гость



 прочитанное сообщение 10.04.2009 10:15     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #63 множественное цитирование

(Гость @ 10.04.2009 11:12)
Ссылка на исходное сообщение  Проблема в отсутствии нужных знаний... Все остальное есть


Начинать нужно с заучивания статьи Инниса и Гельфанда
"Оптимизация ПЦР реакций" и повторять вслух утром и вечером ,
как "Отче наш" smile.gif

Innis MA and Gelfand DH (1990). Optimization of PCRs. pp. 3-12 in: PCR Protocols
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 10.04.2009 11:09     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #64 множественное цитирование

(Гость @ 10.04.2009 10:24)
Ссылка на исходное сообщение  Вопрос от чайника. Сколько нужно взять праймера концентрацией 88 pmol/mkl, молярная масса 5530, чтобы финальная концентрация в 20 мкл была  от 0,1 до 0,5 мкМ

88 pmol/mkl - надеюсь это выражение концентрации вы понимаете. А вот
0,1 до 0,5 мкМ означает микромоли праймера в ЛИТРОВОМ объеме (большая буква М в мкМ на это указывает). Осталось пересчитать на ваши 20 мкл.
Участник оффлайн! Vovka Genetik




 прочитанное сообщение 22.04.2009 20:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #65 множественное цитирование

[Подскажите, какие праймеры используют для ПЦР на объекте Linum ucitatissimum (лен). Заранее благодарен]
Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 23.04.2009 17:24     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #66 множественное цитирование

(Vovka Genetik @ 22.04.2009 20:07)
Ссылка на исходное сообщение  [Подскажите, какие праймеры используют для ПЦР на объекте Linum ucitatissimum (лен). Заранее благодарен]

В переводе на русский: Доктор, ... у меня ... э-это... frown.gif confused.gif
Участник оффлайн! achiffa
Участник



 прочитанное сообщение 08.07.2014 13:45     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #67 множественное цитирование

Здравствуйте!
Вопрос такой: для обратной траскрипции и амплификации кДНК в одной пробирке (1 step RT-PCR) можно использовать смесь dNTP с dTTP? А то вот этой инструкции Applied Biosystems предлагает почему-то dUTP вместо dTTP.
http://tools.lifetechnologies.com/content/.../cms_040930.pdf
Участник оффлайн! Alex2006
Постоянный участник
Берлин



 прочитанное сообщение 08.07.2014 20:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #68 множественное цитирование

предлагает для того,чтобы в двухстадийной РТ-пцр можно было добавлять в мастермиксы урацил-днк-гликозилазу и избирательно элиминировать амплификацию с продукта предыдущих реакций, дабы избежать контаминации. dTTP в принципе использовать можно.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): achiffa
Участник оффлайн! achiffa
Участник



 прочитанное сообщение 09.07.2014 13:26     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #69 множественное цитирование

Может, кто-то сможет прояснить, зачем тогда в АВ кладут в кит для 1 step RT-PCR всё тот же dUTP, если при этом нельзя использовать урацил-днк-гликозилазу?
http://tools.lifetechnologies.com/content/...ls/4393463D.pdf
Участник оффлайн! Alex2006
Постоянный участник
Берлин



 прочитанное сообщение 09.07.2014 16:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #70 множественное цитирование

Все просто - использование UDG имеет смысл только лишь в том случае, если ВСЕ пцр реакции данной лаборатории делаются на dUTP или на смеси dUTP/dTTP. Если где-то использовать , а где-то нет, то толку не будет, т.к. не всю левую днк от предыдущих амплификаций можно будет убрать из смеси перед пцр.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.07.2014 12:25     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #71 множественное цитирование

(achiffa @ 08.07.2014 14:45)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!
Вопрос такой: для обратной траскрипции и амплификации кДНК в одной пробирке (1 step RT-PCR) можно использовать смесь dNTP с dTTP? А то вот этой инструкции Applied Biosystems предлагает почему-то dUTP вместо dTTP.
http://tools.lifetechnologies.com/content/.../cms_040930.pdf

Значит, эту инструкцию читали невнимательно. Там есть ссылка на эту классику.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2716852
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2227421
(к сожалению у меня нет фултекста).
Для расширения кругозора можете почитать:
http://jcm.asm.org/content/31/9/2356.full.pdf
На коротких GC-богатых ампликонах можно проколоться - основной недостаток UNG.
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  27.11.2021 15:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #72 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  28.12.2022 08:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #73 множественное цитирование

https://medium.com/@omegawatches89/exciting...ne-17c41f48bce4
https://telegra.ph/Tips-For-Buying-Replica-Watches-08-03
https://disqus.com/by/omegawatches89/about/
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040004/
https://omegawatches89.bigcartel.com/product/replica-watches
https://teletype.in/@omegawatches89/p6FG7kdedpw
https://dailygram.com/index.php/blog/116219...eplica-watches/
https://www.craftsforum.co.uk/member/209770-omegawatches89
https://forum.amando.it/members/omegawatches89-165008.html
https://www.academia.edu/88309718/https_www_watchesbiz_co_
https://codepen.io/omegawatches89/pen/KKRbyKj
https://musescore.com/user/54310503/sets/5621730
https://form.jotform.com/223253838439059
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/amazi...-watches-online
https://teletype.in/@omegawatches89/FclnTDwlkB1

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 09:22
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft