Большое спасибо всем, кто откликнулся!
Dear Shafei, очень признательна за Ваше интересное обсуждение и любезное предложение выслать литобзор – это было бы очень ценно для меня! (mail: mersiv@online.ru)
Во-первых, поясню, почему вообще у меня возникла необходимость заниматься функциональным анализом мутаций на уровне белка:
Вообще-то, наша лаборатория занимается генетическим картированием локусов наследственных болезней, с последующей идентификацией гена (если ОЧЕНЬ повезет
). Часто новый локус бывает картирован в одной-единственной семье. Причем, внутри картированной области оказывается, как правило, не один ген-кандидат. Поэтому, стоИт задача не только найти мутацию, но и доказать, что именно это изменение и есть _патогенная_мутация_, а не просто полиморфизм (редкий нормальный аллельный вариант), лежащий рядом с истинным геном.
Часто картированные новые генетические формы оказываются настолько редкими, что нашей выборки больных со сходным фенотипом просто не хватает, чтобы найти среди них еще хоть одну дополнительную семью с мутацией в том же гене. Так что остается только доказывать на моделях, что данная замена в гене действительно вызывает функциональные изменения в клетке/организме, похожие на изучаемую болезнь. Да и не солидно уже как-то, по международным меркам, выступать без исследования эффекта мутации в новом гене на уровне белка! Ну, и интересно, наконец
Я пока только пытаюсь разобраться, что собой представляет функциональный анализ белка, реально ли что-то сделать в России (и что именно), а также оценить, можем ли мы заинтересовать коллег на Западе с точки зрения совместного гранта (в принципе, личные контакты есть).
Словом, нахожусь на стадии "теоретической подготовки и построения прожектов" :-)
И не уверена, стОит ли грузить форум моей узкой тематикой...
Если кто-то работает (или работал раньше, но готов помочь советом) в близкой области – отзовитесь, пожалуйста, напишу более подробно e-mail’ом!
Если кратко:
Изучаемая мною болезнь называется "наследственная мотосенсорная нейропатия", или болезнь Шарко-Мари-Тута (Charcot-Marie-Tooth disease, "СМТ"), ее аксональный вариант.
Интересующих генов у меня, собственно, два (пока :-))- один хорошо известный (легкая цепь нейрофиламента), а другой относительно новый и слабо изученный (в плане функции белка) - второй ген назвать пока, увы, не могу (не разрешают).
Мутация во втором гене найдена только в одной семье (правда, большой), и требуется получить доказательства, что это действительно патогенная мутация.
Возможность анализа на культуре я ни вкоем случае не отбрасываю - напротив, если мы будем этим заниматься, то с нее и начнем.
Только не знаю - есть ли культуры, которые экспрессируют (хотя бы приблизительно) набор генов нервной клетки? Можно ли хотя бы сравнить, будут ли какие-то изменения в линии, трансформированной геном с мутацией по сравнению с линией, трансформированной нормальным геном? Какие векторы обычно для этого используют? Аденовирусные?
Культура нейробластов – это вообще реально?
Есть какой-то банк данных по культурам клеток, с описанием их фенотипа, что экспрессируют? Если не трудно, дайте ссылочку?
Кстати, может, кто-то знает, что такое "Vero cells" - японцы на них эффект мутантного нейронального кинезина изучали (из какой ткани выведена эта культура клеток?)
А вот с антисенсами ничего, боюсь, не выйдет (прав на 100% guest2): мутация доминантная, типа "gain of function", а у нокаутов (по нейрофиламенту такие есть) вообще ничего похожего на исследуемую нейропатию нет (собственно, и мыши, и перепела спокойно живут вообще без нейрофиламентов !!!). Т.е. уменьшать количество экспрессируемого гена не имеет смысла – скорее уж, имитировать гиперэкспрессию. Опять же, для нейрофиламента такие работы по гиперэкспрессии были – и получили они в результате нечто похожее на боковой амиотрофический склероз (дегенерация мотонейрона), а никак не мотосенсорную периферическую нейропатию. А вот у японцев, которые кинезин иследовали (это - второй известный ген моей болезни) – миссенс-мутация у человека и нокаут у мыши (в гетерозиготе и то и другое) дали сходный фенотип. Так что c новым геном нужно бы, конечно, вводить мутацию, хотя догадываюсь, что это почти нереально.
Мне еще такая фраза у японцев в статье понравилась: “Q98L mutation was introduced into a full-length mouse kif1B cDNA with PCR amplification and confirmed by sequencing.”. И все, описание метода на этом закончилось! Типа, “Это же элементарно!” Да-а, они явно живут в XXII веке, а мы в XIX!
Идеальным было бы, конечно, набрать препаратов нервов у больных с мутациями в разных доменах, и покрасить их антителами к определенным белкам. Но, увы, у человека вообще трудно материал взять (больно это, а больным от этого исследования – никакой пользы), а тут еще из всех семей только одна – наша русская, а остальные – бельгийцы, болгары, американцы, и т.д. У них такие законы, что и кровь-то для научного исследования не просто взять, не то что нерва кусок! А может, просто наши западные коллеги связываться не хотят... В любом случае, пытаюсь сейчас «провентилировать» все возможные направления – не выйдет ничего, так хоть что-то новое узнаю :-) А действовать будем по принципу "наименьшего сопротивления".
Еще раз всем спасибо за поддержку и информацию!