Полная версия страницы  English  

Трансгенные животные

Anonymous, 14.01.2002 07:33
Дорогие коллеги!
У меня вопрос из серии "с чего начать?" :-)
Не подскажете ли, кто в Москве (или вообще в России) занимается созданием трансгенных животных?
Насколько реально сделать такую работу в России? (если допустить, что деньги на нее будут)?
Если кто-нибудь знает - подскажите, где (в каких журналах, а может быть, на web-сайтах) можно почитать про _технологию_ этого дела?
Нахожу пока только статьи, где описывается эффект, полученный в результате gene targeting strategy; в лучшем случае, там описана конструкция вектора. А что с собственно мышами-то делают? Как его (ген) туда вводят? В зиготу, что ли, вектор колют, а потом он в геном встраивается? (рекомбинирует с нормальным геном?). Это сколько же тогда этих зигот нужно трансформировать, чтобы получить хоть одну рекомбинантную, да еще чтобы она выжила?!
Только не ругайтесь, пожалуйста, если я по своему невежеству глупость написала :-), и расскажите, кто знает, как оно на самом деле происходит!
Собственно, проблема у меня вот какая:
Есть мутация в гене аксонального белка. Предположительно - этот белок выполняет цитоскелетную функцию; экспрессируется специфически только в нервных клетках ЦНС. Мутация (доминантная, миссенс) у человека приводит к периферической нейропатии (аксональная дегенерация + демиелинизация).
Нужно посмотреть влияние мутации в этом гене на экспрессию других белков нервной клетки (особенно интересуют те, что представлены потом на аксолемме); хорошо бы еще - на цитоскелет и аксональный транспорт.
Животные со спонтанными мутациями в этом гене не описаны.
Мне, увы, ничего не приходит в голову, кроме создания трансгенных животных - т.к. культура, даже нейробластов - это не совсем то (нужно еще посмотреть и влияние на шванновские клетки и миелинизацию), а ковырять спинной мозг из больных (вполне живых и относительно здоровых), естественно, нельзя :0).
Можно, правда, наковырять немного периферического нерва (но ОЧЕНЬ немного, да и то - если удастся уломать хоть одного больного smile.gif
Как, интересно, в дистальной части аксона обстоит дело с представленностью мРНК?
Еще существует, пожалуй, возможность получить гистологические препараты - опять-таки, периферического (подкожного) нерва.
Может быть, кто-то поделится идеей, что еще тут можно сделать?
Заранее очень благодарна за любую помощь!
Anonymous, 14.01.2002 11:09
А можно чуть более подробно про болячку, белок и и т.п. ? Потому как сделать трансгеную кухню под анализ мутации - дело дорогое и долгое. И результаты не факт что будут адекватны тому, что есть у человека.
Anonymous, 14.01.2002 14:49
Уважаемая Imers!
По поводу трансгенных технологий я могу прислать Вам обзор литературы из моего диплома. Он 1994 года, но кое-что полезное в нем есть.
Guest, отвечавший выше был совершенно прав: получить трансгенную мышь - дело сложное, долгое и неблагодарное. Это как если бы Вам нужно было провести эксперимент в условиях разреженной атмосферы и Вы интересовались бы, каким образом можно запустить спутник.
Насколько я понял, Вам ведь нужна мышь не с прибавленным, а, так сказать, с убавленным геном. Значит, нужно не колоть ген в зиготу, а получать сначала генетически модифицированную линию эмбриональных стволовых клеток и затем создавать химерных зародышей. Такими вещами, насколько мне известно, в Москве занимались только в Институте молекулярной генетики РАН. Вообще, о трансгенозных лабораториях я писал в топике "клонирование животных".
Насколько я понял, о функциях белка ничего неизвестно: то ли это структурный белок, то ли регуляторный, то ли, каким-то образом, и то и другое. А о гомологичном белке и соответствующем гене у мыши что-нибудь известно? Может быть, сначала исследовать локализацию экспрессии этого гена мыши в развитии. В нейробластах есть экспрессия? Если есть, может быть, не отметать работу с культурой клеток. У мыши, наверно, можно и на эксплантатах нервов работать. Может быть, можно их кратковременную культуру ставить. Может быть, подавлять экспрессию в эксплантатах и культурах антисмысловыми РНК и олигонуклеотидами? Даже если вводить антисенсы в эмбрионы - это и то проще, чем генный таргетинг устраивать.
Еще совет: у журнала Development - свободный доступ к статьям; попробуйте найти аналогичные работы по генному таргетингу и антисенсам, сделанные на других белках.
Anonymous, 14.01.2002 18:01
Все дажехуже чем сказал Shafei - требуется ведь не просто сделать нокаут, а заменить нормальный ген на ген с мутацией. Так что предлагаемый вариант с анализом для начала нормальной функции искомого белка на мышках возможно самый правильный. При этом ко всему следует подходить с осторожностью. Скажем, антисенс в этой ситуации не является адекватной заменой доминантной миссенс мутации - совсем другие механизмы реализации патогенеза. Антисенс - это модель снижения дозы гена или падения активности белкафермента. Доминантный миссенс скорее всего имеет доминантно-негативный эффект - но может вести и к появлению у белка новой функциональной - причем патологической - активности.
Anonymous, 15.01.2002 09:18
Большое спасибо всем, кто откликнулся!
Dear Shafei, очень признательна за Ваше интересное обсуждение и любезное предложение выслать литобзор – это было бы очень ценно для меня! (mail: mersiv@online.ru)
Во-первых, поясню, почему вообще у меня возникла необходимость заниматься функциональным анализом мутаций на уровне белка:
Вообще-то, наша лаборатория занимается генетическим картированием локусов наследственных болезней, с последующей идентификацией гена (если ОЧЕНЬ повезет smile.gif). Часто новый локус бывает картирован в одной-единственной семье. Причем, внутри картированной области оказывается, как правило, не один ген-кандидат. Поэтому, стоИт задача не только найти мутацию, но и доказать, что именно это изменение и есть _патогенная_мутация_, а не просто полиморфизм (редкий нормальный аллельный вариант), лежащий рядом с истинным геном.
Часто картированные новые генетические формы оказываются настолько редкими, что нашей выборки больных со сходным фенотипом просто не хватает, чтобы найти среди них еще хоть одну дополнительную семью с мутацией в том же гене. Так что остается только доказывать на моделях, что данная замена в гене действительно вызывает функциональные изменения в клетке/организме, похожие на изучаемую болезнь. Да и не солидно уже как-то, по международным меркам, выступать без исследования эффекта мутации в новом гене на уровне белка! Ну, и интересно, наконец smile.gif
Я пока только пытаюсь разобраться, что собой представляет функциональный анализ белка, реально ли что-то сделать в России (и что именно), а также оценить, можем ли мы заинтересовать коллег на Западе с точки зрения совместного гранта (в принципе, личные контакты есть).
Словом, нахожусь на стадии "теоретической подготовки и построения прожектов" :-)
И не уверена, стОит ли грузить форум моей узкой тематикой...
Если кто-то работает (или работал раньше, но готов помочь советом) в близкой области – отзовитесь, пожалуйста, напишу более подробно e-mail’ом!
Если кратко:
Изучаемая мною болезнь называется "наследственная мотосенсорная нейропатия", или болезнь Шарко-Мари-Тута (Charcot-Marie-Tooth disease, "СМТ"), ее аксональный вариант.
Интересующих генов у меня, собственно, два (пока :-))- один хорошо известный (легкая цепь нейрофиламента), а другой относительно новый и слабо изученный (в плане функции белка) - второй ген назвать пока, увы, не могу (не разрешают).
Мутация во втором гене найдена только в одной семье (правда, большой), и требуется получить доказательства, что это действительно патогенная мутация.
Возможность анализа на культуре я ни вкоем случае не отбрасываю - напротив, если мы будем этим заниматься, то с нее и начнем.
Только не знаю - есть ли культуры, которые экспрессируют (хотя бы приблизительно) набор генов нервной клетки? Можно ли хотя бы сравнить, будут ли какие-то изменения в линии, трансформированной геном с мутацией по сравнению с линией, трансформированной нормальным геном? Какие векторы обычно для этого используют? Аденовирусные?
Культура нейробластов – это вообще реально?
Есть какой-то банк данных по культурам клеток, с описанием их фенотипа, что экспрессируют? Если не трудно, дайте ссылочку?
Кстати, может, кто-то знает, что такое "Vero cells" - японцы на них эффект мутантного нейронального кинезина изучали (из какой ткани выведена эта культура клеток?)
А вот с антисенсами ничего, боюсь, не выйдет (прав на 100% guest2): мутация доминантная, типа "gain of function", а у нокаутов (по нейрофиламенту такие есть) вообще ничего похожего на исследуемую нейропатию нет (собственно, и мыши, и перепела спокойно живут вообще без нейрофиламентов !!!). Т.е. уменьшать количество экспрессируемого гена не имеет смысла – скорее уж, имитировать гиперэкспрессию. Опять же, для нейрофиламента такие работы по гиперэкспрессии были – и получили они в результате нечто похожее на боковой амиотрофический склероз (дегенерация мотонейрона), а никак не мотосенсорную периферическую нейропатию. А вот у японцев, которые кинезин иследовали (это - второй известный ген моей болезни) – миссенс-мутация у человека и нокаут у мыши (в гетерозиготе и то и другое) дали сходный фенотип. Так что c новым геном нужно бы, конечно, вводить мутацию, хотя догадываюсь, что это почти нереально.
Мне еще такая фраза у японцев в статье понравилась: “Q98L mutation was introduced into a full-length mouse kif1B cDNA with PCR amplification and confirmed by sequencing.”. И все, описание метода на этом закончилось! Типа, “Это же элементарно!” Да-а, они явно живут в XXII веке, а мы в XIX!
Идеальным было бы, конечно, набрать препаратов нервов у больных с мутациями в разных доменах, и покрасить их антителами к определенным белкам. Но, увы, у человека вообще трудно материал взять (больно это, а больным от этого исследования – никакой пользы), а тут еще из всех семей только одна – наша русская, а остальные – бельгийцы, болгары, американцы, и т.д. У них такие законы, что и кровь-то для научного исследования не просто взять, не то что нерва кусок! А может, просто наши западные коллеги связываться не хотят... В любом случае, пытаюсь сейчас «провентилировать» все возможные направления – не выйдет ничего, так хоть что-то новое узнаю :-) А действовать будем по принципу "наименьшего сопротивления".
Еще раз всем спасибо за поддержку и информацию!
Anonymous, 15.01.2002 10:25
Vero cells - культура клеток поджелудочной железы зеленой мартышки. Слово "Vero", я так думаю, есть в родовом или видовом названии этой мартышки, но не уверен.
Anonymous, 15.01.2002 15:35
Инъекция конструкции производится не просто в зиготу, а в пронуклеус, поэтому дело еще сложнее, но я где-то читал(сейчас не помню)про то как брали конструкцию на основе ретровируса и загоняли в семенники самцов, это немного проще но процент выживших трансгенов еще меньше чем при стандартных методах.акже очень сильно влияет величина конструкции. Насчет того делают ли в России, делают и даже на заказ наверное тоже. В Москве в Биогене (Мыши), в Биотехцентре(кролики), в Питере тоже, но где не помню. Если надо, то мыльте.
Anonymous, 15.01.2002 16:32
А что у вас с сцеплением с этой самой мутацией ? Какой lod ? Какая частота данной мутации на 100 случайных лиц ?
Кстати, если gain of function - нокаут как раз может что-то дать. Но как я понимаю именно то что gain и не показано.
moonlife447, 25.09.2022 12:00
F1 Renovations is one of the leading renovation companies all over the UK. We provide painting and decorating services, including all types of decoration like house renovation, kitchen renovation, bathroom renovation, tiling, flooring, etc. We provide quality service at cheap rates.

Removals Company | Removals Company | Office Removal in London | Office Removals London | Relocation Companies London | Removals Company in London | Moving Company in London | Moving Company | Movers in London | Man and Van in London | House Removals in London | House Removals | Packers and movers in London | Packers and movers London | Movers and Packers in London | Relocation Company in London | Commercial Removals | Local Movers | Long Distance Mover | Long Distance Movers | Long Distance Moving Company | renovations | london renovations | renovation companies in london | renovations company london | house renovation in london | Kitchen renovation london | Kitchen fitting london | Kitchen fitters in London | bathroom renovations london | painters and decorators in london | painting and decorating in london | painters in london | london decorators | vinyl tile flooring | vinyl flooring | laminate flooring | parquet flooring | wood flooring | parquet flooring london | luxury vinyl flooring | lvt flooring | wood flooring london | karndean flooring | herringbone flooring | laminate flooring london | amtico flooring | bathroom floor tiling | bathroom tiling | kitchen tiling | floor tiling | porcelain tiling | terrazzo tiling
Ufa1688, 28.09.2022 11:57
On the network’s flagship aff 1688evening newscast, ทางเข้าufa1688Xi was shown wearing ufabet เข้า สู่ระบบa face mask and viewing ufa1688the displays at the Beijing ราคาบอลExhibition Hall where photos สล็อตออนไลน์of himself featured heavily. UFA1688He was accompanied by Premier ลิงค์รับทรัพย์Li Keqiang and other top leaders, แฮนดิแคปincluding all members of the party’s บอลสเต็บsupreme Politburo Standing Committee.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.