Добрый день,
Начал работать с лентивирусными системами и возникло несколько вопросов.
1. Можно ли инфицировать культуру одновременно двумя лентевирусами.
Мне нужно, чтобы один нес shRNA, а другой GFP слитный белок. Нужна transient экспрессия.
2. Есть ли разница по эффективности трансфекции среди разных лентивирусных систем, что лучше? Наверное, ткане специфично, мне нужно для MEFs и гадкомышечных крысиных клеточный линий.
3. С лентивирусами пришлось работать, потому что все, что я пробовал для трансфекции siRNA, так или иначе влияет на мой белок. Можно ли решить эту проблему иным способом?
4. Может кто-нибудь знает обзорчик по разным лентивирусным системам?
Заранее премного благодарен!!!
 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
Лентивирусные системы
Parhit, 10.02.2007 02:10
Fedo, 11.02.2007 22:26
1. Mozhno, no !!! a) luchsche eto delat' poocheredno... vnachale pervym virusom, zatem vtorym... b) pri lentivirusah u vas budet integrazija v genom, chto oznachaet vy ne poluchite transient expression, dlja transientnoy expressii genov - ispol'zujut transfekziju, a ne transdukziju...
2. A mnogo sistem vy znaete? Kak pravilo eto vse 1 i to zhe... Fragment chto mezhdu LTR vstraivaetsja v Genome... Kak pravilo ispol'zujut VSV-G... nu v obschem pochitayte escho paru review... Didier Trono naprimer...
3. Konechno vlijaet... Pri transfekzii siRNA, esli oni spezifichny - vy poluchite knock-down...
4. Po raznym ne znaju... A vot po lentivirusam dlja shRNA - smotrite Didier Trono...
2. A mnogo sistem vy znaete? Kak pravilo eto vse 1 i to zhe... Fragment chto mezhdu LTR vstraivaetsja v Genome... Kak pravilo ispol'zujut VSV-G... nu v obschem pochitayte escho paru review... Didier Trono naprimer...
3. Konechno vlijaet... Pri transfekzii siRNA, esli oni spezifichny - vy poluchite knock-down...
4. Po raznym ne znaju... A vot po lentivirusam dlja shRNA - smotrite Didier Trono...
Parhit, 12.02.2007 04:05
Большое спасибо за советы, особенно за Didier Trono!!!
Неправильно выразился насчет transient, я имел в виду, что мне не нужна последующая селекция и поддержание данной клеточной линии. Я добавил частицы, через три дня уровень белка падает до 5%, я по-разному воздействую на клетки и собираю их для вестерна.
siRNA трансфекция, тоже самое, только если добавлять TKO реагент один, он, как минимум в 2 раза, усиливал наблюдаемый мною эффект, поэтому от него пришлось отказаться.
А как замораживание влияет на трансфекцию. На форуме писали, что частицы потом не работали. У нас ретровирусный частицы замораживают, а потом титр падает в 2 раза, но этого все равно предостаточно, а как с лентивирусными?
Если полибрен был добавлен до замораживания, нужно ли его еще раз добавлять после размораживания?
Заранее благодарен!!!
Неправильно выразился насчет transient, я имел в виду, что мне не нужна последующая селекция и поддержание данной клеточной линии. Я добавил частицы, через три дня уровень белка падает до 5%, я по-разному воздействую на клетки и собираю их для вестерна.
siRNA трансфекция, тоже самое, только если добавлять TKO реагент один, он, как минимум в 2 раза, усиливал наблюдаемый мною эффект, поэтому от него пришлось отказаться.
А как замораживание влияет на трансфекцию. На форуме писали, что частицы потом не работали. У нас ретровирусный частицы замораживают, а потом титр падает в 2 раза, но этого все равно предостаточно, а как с лентивирусными?
Если полибрен был добавлен до замораживания, нужно ли его еще раз добавлять после размораживания?
Заранее благодарен!!!
E., 12.02.2007 11:04
(Parhit @ 12.02.2007 03:05)
А как замораживание влияет на трансфекцию. На форуме писали, что частицы потом не работали. У нас ретровирусный частицы замораживают, а потом титр падает в 2 раза, но этого все равно предостаточно, а как с лентивирусными?
Да, особо никак.
проверял 1 - 1,5 летнюю "фасовку" лентивирусов - такое впечатление что вчера делал - все замечательно трансфециркуется.
P.S.: надо бы "цветочек благодарностей" куда нибудь сдвинуть - а то все время при цитировании на него тыкаешь.
E., 12.02.2007 11:07
2 Parhit: а Вы чью систему использовали если не секрет?
Fedo, 12.02.2007 16:53
Ja sam ne morozil virusy... Delal noviy...
Sosed po parte govorit chto effektivnost' padaet, no ne osobo - koroche mona morozit'...
Po powodu Trono... U nego v laboratorii sdelali Vektor, kotoriy pozvoljaet odnovremenno expressirovat' shRNA i transgen... To est' vy vse svoi experimenty mozhete zasunut' v 1 transdukziju... Nu konechno predvaritel'no powoziwschis' s klonirovaniem... Oni vysylajut etu Vektor besplatno... Smotrite ih stat'i gde-to nachalo 2006 goda... Libo konez 2005...
E. vy navernoe imeli vvidu Transduction, a ne Transfection?
Sosed po parte govorit chto effektivnost' padaet, no ne osobo - koroche mona morozit'...
Po powodu Trono... U nego v laboratorii sdelali Vektor, kotoriy pozvoljaet odnovremenno expressirovat' shRNA i transgen... To est' vy vse svoi experimenty mozhete zasunut' v 1 transdukziju... Nu konechno predvaritel'no powoziwschis' s klonirovaniem... Oni vysylajut etu Vektor besplatno... Smotrite ih stat'i gde-to nachalo 2006 goda... Libo konez 2005...
E. vy navernoe imeli vvidu Transduction, a ne Transfection?
Sergeant, 12.02.2007 17:52
1. Первая система из лаборатории Дитера Троно для регулируемий экспресии построена на применении двух разных вирусов. И отлично работает. А более поздняя их работа когда в один вектор запихнули и белок-регулятор и siRNA деалась скорее для in vivo экспериментов.
2. Практически все лентивирусные системы используют капсидный белок VSV-G.
Устойчивость высокая, а долбит почти любые клетки. А для тканеспечефичной экспресии вам нужен тканеспечефичный промотер.
Бесплатно отдаю идею (сам использовал) как за неделю делать десяток РАЗНЫХ лентивиросов под экспрессию не сильно напрягаясь на работе. Я заменил tTR-KRAB
в pLV-tTRKRAB-Red на инвитрогеновскую кассету attR-Cvr-ccdB-attR из Vector Conversion System. Теперь с утра ставим PCR, на следущее утро уже отбераем нужные клоны в pENTR-TOPO, а если все нормально то на следущий день и клоны после Gateway рекомбинации. И никакой мороки с обычным клонированием. А главное, можно не напрягаясь делать паралельно хоть сто разных лентивирусов.
2. Практически все лентивирусные системы используют капсидный белок VSV-G.
Устойчивость высокая, а долбит почти любые клетки. А для тканеспечефичной экспресии вам нужен тканеспечефичный промотер.
Бесплатно отдаю идею (сам использовал) как за неделю делать десяток РАЗНЫХ лентивиросов под экспрессию не сильно напрягаясь на работе. Я заменил tTR-KRAB
в pLV-tTRKRAB-Red на инвитрогеновскую кассету attR-Cvr-ccdB-attR из Vector Conversion System. Теперь с утра ставим PCR, на следущее утро уже отбераем нужные клоны в pENTR-TOPO, а если все нормально то на следущий день и клоны после Gateway рекомбинации. И никакой мороки с обычным клонированием. А главное, можно не напрягаясь делать паралельно хоть сто разных лентивирусов.
Sergeant, 12.02.2007 17:56
PS Бесплатная халява у Тронолабовцев кончилась. Они передали функции рассылки векторов в какую то некомерческую фирму. Теперь только за деньги, но цены действительно разумные.
Parhit, 12.02.2007 18:41
Mne dali Invitrogenовскую систему, три плазмиды: PLP1, PLP2 и VSVG.
Моя shRNA в pLKO.1 векторе.
Я трансфецирую 293T клетки с четырьмя плазмидами, на следующий день меняю среду, еще через 2 дня собираю среду с клеток, пропускаю через 0.45 фильтр, добавляю полибрен 8 мкг.мл и добавляю 1 мл на 6луночную чашку. На следующий день меняю среду, а через 2 дня собираю лизаты для вестерна.
К сожалению, вместе с нашими pLKO.1 shRNA плазмидами, прислали сдохший сток с контрольной плазмидой (SHC002), поэтому как контроль приходится использовать пустой вектор.
А почему, если все используют VSV-G, у одних клеток 5% эффективность, а у других 95%?
Не совсем понятно с полибреном, или он никак не будет влиять на выживаемость?
А как влияет пен/стреп смесь на продукцию, почему нужно растить в среде без антибиотика?
To Sergeant:
Большое спасибо за совет, но я пока не могу его оценить, за полным незнанием всего этого.
У меня может быть все просто, в полилинкере pLKO.1 есть Age1 и EcoR1 сайты, и в GFPслитном белочке теже самые, вот по ним и собираюь переклонировать.
Моя shRNA в pLKO.1 векторе.
Я трансфецирую 293T клетки с четырьмя плазмидами, на следующий день меняю среду, еще через 2 дня собираю среду с клеток, пропускаю через 0.45 фильтр, добавляю полибрен 8 мкг.мл и добавляю 1 мл на 6луночную чашку. На следующий день меняю среду, а через 2 дня собираю лизаты для вестерна.
К сожалению, вместе с нашими pLKO.1 shRNA плазмидами, прислали сдохший сток с контрольной плазмидой (SHC002), поэтому как контроль приходится использовать пустой вектор.
А почему, если все используют VSV-G, у одних клеток 5% эффективность, а у других 95%?
Не совсем понятно с полибреном, или он никак не будет влиять на выживаемость?
А как влияет пен/стреп смесь на продукцию, почему нужно растить в среде без антибиотика?
To Sergeant:
Большое спасибо за совет, но я пока не могу его оценить, за полным незнанием всего этого.
У меня может быть все просто, в полилинкере pLKO.1 есть Age1 и EcoR1 сайты, и в GFPслитном белочке теже самые, вот по ним и собираюь переклонировать.
Sergeant, 12.02.2007 20:07
Полибрен для инфекции не обязателен. Может быть токсичен для некоторых типов клеток. Эффективность инфекции очень сложный и комплексный параметр, который зависит не только от белка оболочки вируса. Пен/стреп слабо (или вообще не влияет) влияет на эффективность инфекции. Лучше работать с ним, поскольку когда концентрируеш лентивирус центрифугированием, есть шанс контаминации.
Если схема клонирования простая и белок не большой, то делать надо как просче. Я описал случай, когда надо делать много разных конструктов, в том числе и с большими вставками кДНК, для которых обычно просто нет удобных сайтов клонирования. Или представте, есть рецептор на 180 kD и надо сделать десяток его мутантов.
Если схема клонирования простая и белок не большой, то делать надо как просче. Я описал случай, когда надо делать много разных конструктов, в том числе и с большими вставками кДНК, для которых обычно просто нет удобных сайтов клонирования. Или представте, есть рецептор на 180 kD и надо сделать десяток его мутантов.
freshman, 08.03.2008 02:46
Наверно поздно встревать в разговор, но хочется спросить знающих людей.
___________________________
Sergeant, 12.02.2007 06:52
1. Первая система из лаборатории Дитера Троно для регулируемий экспресии построена на применении двух разных вирусов. И отлично работает. А более поздняя их работа когда в один вектор запихнули и белок-регулятор и siRNA деалась скорее для in vivo экспериментов.
2. Практически все лентивирусные системы используют капсидный белок VSV-G.
Устойчивость высокая, а долбит почти любые клетки. А для тканеспечефичной экспресии вам нужен тканеспечефичный промотер.
Бесплатно отдаю идею (сам использовал) как за неделю делать десяток РАЗНЫХ лентивиросов под экспрессию не сильно напрягаясь на работе. Я заменил tTR-KRAB
в pLV-tTRKRAB-Red на инвитрогеновскую кассету attR-Cvr-ccdB-attR из Vector Conversion System. Теперь с утра ставим PCR, на следущее утро уже отбераем нужные клоны в pENTR-TOPO, а если все нормально то на следущий день и клоны после Gateway рекомбинации. И никакой мороки с обычным клонированием. А главное, можно не напрягаясь делать паралельно хоть сто разных лентивирусов.
____________________________________________
Можно попросить у Sergeant его верестроенный вариант pLV-tTRKRAB-Red c кассетой attR-Cvr-ccdB-att ? Очень надо!!! И что такое pENTR-TOPO?
Второй вопрос. Я пробую оптимизировать человеческие фибробласты к инфекции тоже лентивирусом и тоже с касетой tTRKRAB, только у нас в лабе pLVCT-tTR-KRAB.
Но у меня мало что получилось. Нет нашего любимого зелёного белка! Молчит мой вирус. Или вообще его там нет, в супере.
Но я не много запутался. Помогите понять что к чему.
Мы делал так, как было описано на сайте Addgene, где мы покупали плазмиды.
Cloning shRNA into pLVET, pLVCT, and pLVPT vectors: first clone shRNA into pLVTHM downstream of the tetO-H1 region. Then cut pLVTHM containing your shRNA with MscI-FspI and clone the insert containing the 3'LTR to target plasmid opened with MscI-FspI. FspI cuts into AmpR. This means for inverted clones AmpR will not be restored; after selection you will be left with clones with the shRNA cassette and functional AmpR.
Но когда я поглядел Вашу плазмиду (практически тоже самое), то описание к Вашей плазмиде в инструкциях значится, что надо:
For conditional expression of siRNA, the target cells need to be cotransduced with both pLVTH/pLVTHM and pLV-tTRKRAB/pLV-tTRKRAB-Red to achieve conditional expression of siRNA.
Значит ли это, что можно было бы не мучиться в клонирование сначала в один вектор, потом перекланированием в другой вектор, а можно было просто сделать трансфекцию с Лопофектамином и получился бы тотже результат или даже лучеш (так как мой виру кажется не работает, так ак Джи-Эф-Пи нет).
Буду очень признателен за советы. Что можно попробовать в 2-3 дня (максимум неделя), так как нужны данные для подачи на грант. Что хотябы система работает и у нас есть Джи-Эф-Пи позитивные клетки.
___________________________
Sergeant, 12.02.2007 06:52
1. Первая система из лаборатории Дитера Троно для регулируемий экспресии построена на применении двух разных вирусов. И отлично работает. А более поздняя их работа когда в один вектор запихнули и белок-регулятор и siRNA деалась скорее для in vivo экспериментов.
2. Практически все лентивирусные системы используют капсидный белок VSV-G.
Устойчивость высокая, а долбит почти любые клетки. А для тканеспечефичной экспресии вам нужен тканеспечефичный промотер.
Бесплатно отдаю идею (сам использовал) как за неделю делать десяток РАЗНЫХ лентивиросов под экспрессию не сильно напрягаясь на работе. Я заменил tTR-KRAB
в pLV-tTRKRAB-Red на инвитрогеновскую кассету attR-Cvr-ccdB-attR из Vector Conversion System. Теперь с утра ставим PCR, на следущее утро уже отбераем нужные клоны в pENTR-TOPO, а если все нормально то на следущий день и клоны после Gateway рекомбинации. И никакой мороки с обычным клонированием. А главное, можно не напрягаясь делать паралельно хоть сто разных лентивирусов.
____________________________________________
Можно попросить у Sergeant его верестроенный вариант pLV-tTRKRAB-Red c кассетой attR-Cvr-ccdB-att ? Очень надо!!! И что такое pENTR-TOPO?
Второй вопрос. Я пробую оптимизировать человеческие фибробласты к инфекции тоже лентивирусом и тоже с касетой tTRKRAB, только у нас в лабе pLVCT-tTR-KRAB.
Но у меня мало что получилось. Нет нашего любимого зелёного белка! Молчит мой вирус. Или вообще его там нет, в супере.
Но я не много запутался. Помогите понять что к чему.
Мы делал так, как было описано на сайте Addgene, где мы покупали плазмиды.
Cloning shRNA into pLVET, pLVCT, and pLVPT vectors: first clone shRNA into pLVTHM downstream of the tetO-H1 region. Then cut pLVTHM containing your shRNA with MscI-FspI and clone the insert containing the 3'LTR to target plasmid opened with MscI-FspI. FspI cuts into AmpR. This means for inverted clones AmpR will not be restored; after selection you will be left with clones with the shRNA cassette and functional AmpR.
Но когда я поглядел Вашу плазмиду (практически тоже самое), то описание к Вашей плазмиде в инструкциях значится, что надо:
For conditional expression of siRNA, the target cells need to be cotransduced with both pLVTH/pLVTHM and pLV-tTRKRAB/pLV-tTRKRAB-Red to achieve conditional expression of siRNA.
Значит ли это, что можно было бы не мучиться в клонирование сначала в один вектор, потом перекланированием в другой вектор, а можно было просто сделать трансфекцию с Лопофектамином и получился бы тотже результат или даже лучеш (так как мой виру кажется не работает, так ак Джи-Эф-Пи нет).
Буду очень признателен за советы. Что можно попробовать в 2-3 дня (максимум неделя), так как нужны данные для подачи на грант. Что хотябы система работает и у нас есть Джи-Эф-Пи позитивные клетки.
orun, 05.03.2011 20:29
подскажите пожалуйста, если размер вириона по литературным данным 80-100нм, можно ли полученный сток с вирусом фильтровать через миллипоровский фильтр 0,22мкм?
watchesbiz, 14.12.2021 09:28
denisbeta, 11.06.2023 11:25
11oct
13oct
14oct
15oct
17oct
777
Ufa1688, 12.06.2023 07:33
When I started to work with Terry there were only maybe 10 or 15 photographs that he showed in exhibitions Morgan said. Now we have over 400 of his photographs in circulation around the world out of a million-plus negatives. It’s such a rich archive.” He added “There will be a never-ending supply of new and unseen Terry O’Neills to come.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.