Слышал, что в России сейчас обсуждается уже более 10 проектов по созданию центров геномного секвенирования , работа которых будет построена на использовании секвенаторов нового поколения (FLX, 1G, и SOLiD). В числе соискателей финансирования подобных проектов упоминались Е.Д.Свердлов, К.Г.Скрябин, Н.А.Колчанов, ИМБ, ММА и другие академические и медицинские организации. Буду очень признателен за любые подробности .

В ноябре прошлого года Скр. говорил о GS20 так, как будто бы тот уже у него в кармане (хотя как бы он там поместился )
Однако пока его нет. Что, впрочем, неудивительно.

К настоящему моменту куплены/покупаются минимум 3 системы FLX (у Скрябина, в НПЦ медпомощи детям и еще где-то в Москве). G2 планируется купить для НПЦ медпомощи детям, SOLiD - для Власовского НИИ в Новосибирске. Реально не работает еще ни один прибор. К концу года ситуация должна измениться, т.е. хоть что-то заработает.

GS20 (пиросеквенатор Roche/454) был установлен и запущен в Центре "Биоинженерия" РАН у К.Г.Скрябина к конце ноября или в начале декабря прошлого года.

Если за пол года пиросеквенатор GS20 запускался 10 раз, то это 1...2 раза в месяц . Продолжительность рабочего цикла у него, если не ошибаюсь, 4,5 часа, т.е. при нормальной эксплуатации его можно запускать 2 раза в день (4 раза в сутки) . Тогда при нормальной эксплуатации за пол года должно было "набежать" ~250 (до 500) рабочих циклов, что в 25...50 раз больше нынешнего показателя .

были бы деньги
У нас как водится покупают прибор "шобы было", а потом репу чешут - что бы такое выдающееся на нем сделать. Пока чешут - нужно будет новый брать "шобы было", потому как дешевле быстрее престижнее...

это не совсем так... Рабочий цикл около трех суток. Конечно же не самого секвенирования, а общий. Приготовление библиотек, титрование- это тоже целый день... Так что, чтобы работать по два цикла в день нужно, чтобы параллельно шло около шести задач при 24 часовом рабочем дне. Реальность работы с 454 такова, что приблизительно можно делать один полноценный цикл в неделю. Более того, именно на это рассчитан и "промывочный цикл", его нужно проводить, если прибор проставивает более 7 дней. Так что раз в неделю, господа, ... раз в неделю.

Производительность прибора определяется не расторопность обслуживающего персонала, а продолжительностью рабочего цикла, в течение которого автомат считывает информацию с проточной ячейки. Для GS20 это 4,5 часа. Для FLX - 7,5 часов. Для GA - 2...3 суток при одинарном чтении и 4...6 суток при парном. Для SOLiD - 10 суток при парном чтении (недавно было 6 суток, но они ввели фосфатазную обработку и продолжительность увеличилась).

Ну, а если для простаивающего более недели прибора требуется промывочный цикл, то это просто означает, что работать нужно без простоев.

Впрочем, спасибо за информацию. Как сказал в соседней теме Guest1, у каждого метода секвенирования есть свой "скелет в шкафу", и информация о подобных "скелетах" очень полезна .

"Нужна популяризация de novo секвенирования в российских нии, вузах, ак институтах. Тогда это может создать большую загрузку прибора."

Один из лучших способов популяризации - это данный форум. Если есть желание загрузить имеющийся GS20 работой, то сообщите расценки и/или дайте контактную информацию .

http://genomics.ucr.edu/about/reports/Sequ...n1207_Table.pdf

это сравнение разных next gen секвенаторов по цене и времени и тп

Прикольно - 50 runs в год машинки ценою в 500k$+расходники+зарплата+аренда+ещё что-нибудь. Как же может получиться $1000 за ген/паспорт индивидума ?

Может быть лучше и дешевле SNP?

SNP дешевле, и для непритязательных клиентов, конечно, лучше. Но здесь обсуждаются технологии другого уровня. Про 1000$ речь пока не идёт, но за 40 тыс. евро (SOLiD) и 60 тыс.$ (Illumina) геном уже сделали. Правда, при этом подсчитали только стоимость реактивов, да и повторностей маловато, но лиха беда - начало.

Как там с разработкой отечественных расходников для пиросеквенирования? Уже забросили эту идею, или можно не терять надежду?

Сделать можно, но кто купить? Объём рынка пока оптимизма не внушает, чтобы под него затачиваться...

Итак, в России пока есть только один GS20, который за 8 месяцев своего существования запускался 10 раз.

Есть другие мнения (а также замечания, дополнения и предложения)?

Можно я скажу Я не верю, что машинка запускалась в 10 раз , допускаю, что была попытка ОДИН раз на стартовых реактивах. Я имею еще много чего сказать, но пока воздержусь, с Вашего позволения.

Не вижу оснований для недоверия к информации. представленной уважаемый Guest_ом . Он явно знаком с людьми, приближёнными к GS20 в центре "Биоинженерия" РАН. Также яно и то, что сам он далёк от данной проблемы. Об этом свидетельствует приведённая им цифра для прогонов - ~130 млн. нуклеотидов. Дело в том, что рабочий цикл на на GS20 даёт примерно 100 тыс. последовательностей длиной порядка 100 оснований. При этом общая производительнрость составляет примерно 10 млн. оснований . У более продвинутой модели FLX количество считываемых последовательностей увеличено до 400 тыс., а их длина превышает 200 оснований. В результате производительность рабочего цикла может достигать 100 млн. оснований.

Скорее всего. приведённая Гостем цифра "~130" млн. характеризовала общую длину ДНК, которая была оцифрована за 10 прогонов, "что очень неплохо" (по его же словам), поскольку превышает среднюю расчётную производительность данного прибора для данного количества циклов .

В биоинженерии стоит FLX. За один прогон он, действительно, по расчетам должен делать около 100 млн. Я лично видел обработку результатов, которую делал Genomatix, по данным коллег из ЦБ. 138 миллионов за один прогон. Относительно других прогонов ручаться не могу. Говорят, что за 10 прогонов сделали уже больше миллиарда нуклеотидов....

В ГАТЦе мне показывали , как 454 воспроизводимо "недосчитует" или "пересчитует"
3-5 одинаковых букв подряд - ААААА!!!!!!!
эти участки они пересеквинируют Иллуминой-Солексой при де ново секвенсах.
Пересеквенировать "подозрителъные" места капиллярниками - самасшедствие

Что 138 лимонов за прогон ? Это значит , что 38 лимонов в туалет потому как
скорее всего куча ошибок с коротких и длинных ридов .

Plant Physiol. 2008 Jan;146(1):32-44. Epub 2007 Nov 16.Click here to read Click here to read Links
Transcript profiling by 3'-untranslated region sequencing resolves expression of gene families.
Eveland AL, McCarty DR, Koch KE.

Department of Horticultural Sciences, Plant Molecular and Cellular Biology Program, Genetics Institute, University of Florida, Gainesville, FL 32611, USA.

Differences in gene expression underlie central questions in plant biology extending from gene function to evolutionary mechanisms and quantitative traits. However, resolving expression of closely related genes (e.g. alleles and gene family members) is challenging on a genome-wide scale due to extensive sequence similarity and frequently incomplete genome sequence data. We present a new expression-profiling strategy that utilizes long-read, high-throughput sequencing to capture the information-rich 3'-untranslated region (UTR) of messenger RNAs (mRNAs). Resulting sequences resolve gene-specific transcripts independent of a sequenced genome. Analysis of approximately 229,000 3'-anchored sequences from maize (Zea mays) ovaries identified 14,822 unique transcripts represented by at least two sequence reads. Total RNA from ovaries of drought-stressed wild-type and viviparous-1 mutant plants was used to construct a multiplex cDNA library. Each sample was labeled by incorporating one of 16 unique three-base key codes into the 3'-cDNA fragments, and combined samples were sequenced using a GS 20 454 instrument. Transcript abundance was quantified by frequency of sequences identifying each unique mRNA. At least 202 unique transcripts showed highly significant differences in abundance between wild-type and mutant samples. For a subset of mRNAs, quantitative differences were validated by real-time reverse transcription-polymerase chain reaction. The 3'-UTR profile resolved 12 unique cellulose synthase (CesA) transcripts in maize ovaries and identified previously uncharacterized members of a histone H1 gene family. In addition, this method resolved nearly identical paralogs, as illustrated by two auxin-repressed, dormancy-associated (Arda) transcripts, which showed reciprocal mRNA abundance in wild-type and mutant samples. Our results demonstrate the potential of 3'-UTR profiling for resolving gene- and allele-specific transcripts.

http://www.plantphysiol.org/cgi/reprint/146/1/32

Ясное дело, жемчуг мелковат . Нам бы их проблемы. У нас-то пока даже супчик жидковат .

http://www.genome.org/cgi/reprint/18/1/161

Наткнулся на майский пресс-релиз фирмы Applied Biosystems, посвящённый прогрессу технологии SOLiD:
1. В институте Бродов (Broad Institute) запустили пару секвенаторов и сделали 50 млрд.п.о. за 6 недель .
2. К концу этого периода довели производительность до 13,4 млрд.п.о. за цикл .
3. В самой фирме ABI выход достигает 17 млрд. п.о. за цикл .
4. Продолжительность цикла уменьшилась, но не признаются, на сколько конкретно .
5. В 2009 году планируют увеличить длину секвенирования до 50 п.о. (50х2 п.о. при парном чтении) .

Всё идёт к тому, что в следующем году будут читать геном человека за один заход .

1: Nat Methods. 2008 Jul;5(7):613-9.


Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing.
Cloonan N, Forrest AR, Kolle G, Gardiner BB, Faulkner GJ, Brown MK, Taylor DF, Steptoe AL, Wani S, Bethel G, Robertson AJ, Perkins AC, Bruce SJ, Lee CC, Ranade SS, Peckham HE, Manning JM, McKernan KJ, Grimmond SM.

Expression Genomics Laboratory, Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland, 306 Carmody Road, St. Lucia, Queensland, 4072, Australia.

We developed a massive-scale RNA sequencing protocol, short quantitative random RNA libraries or SQRL, to survey the complexity, dynamics and sequence content of transcriptomes in a near-complete fashion. This method generates directional, random-primed, linear cDNA libraries that are optimized for next-generation short-tag sequencing. We surveyed the poly(A)(+) transcriptomes of undifferentiated mouse embryonic stem cells (ESCs) and embryoid bodies (EBs) at an unprecedented depth (10 Gb), using the Applied Biosystems SOLiD technology. These libraries capture the genomic landscape of expression, state-specific expression, single-nucleotide polymorphisms (SNPs), the transcriptional activity of repeat elements, and both known and new alternative splicing events. We investigated the impact of transcriptional complexity on current models of key signaling pathways controlling ESC pluripotency and differentiation, highlighting how SQRL can be used to characterize transcriptome content and dynamics in a quantitative and reproducible manner, and suggesting that our understanding of transcriptional complexity is far from complete.

В общем, рубеж в 10 Gb за рабочий цикл уже преодолён. При десятикратном чтении на геном человека требуется всего 6 циклов.

Недавно смотрел Y-хромосому Уотсона. Его геном прочли шестикратно. Очень дырявая картинка! Аутосомы выглядят лучше, т.к. для Y-хромосомы чтение оказалось не более, чем троекратным.

With 15 GB on GA II and Avantome Buy,
Illumina Confident in Next-Gen Battle

[July 29, 2008]

By Julia Karow

Internally, through improvements in the chemistry and software, Illumina is now able to generate 15 gigabases of sequence data per run on its Genome Analyzer, and it has “clearly defined a roadmap to reach 20 gigabases or beyond by the end of this year.”

Откуда этот Мустафа взялся ?

Illumina to Buy Avantome for Up to $60M;
Long, Cheap Reads Will Target Sanger

[July 29, 2008]

By Julia Karow

The company was co-founded by Mostafa Ronaghi, a principal investigator at the Stanford Genome Technology Center. He is one of the inventors of pyrosequencing and a previous collaborator of Illumina. Illumina hopes that the new technology, which may compete with 454’s platform, will complement its Genome Analyzer.

Иранец. Был рабочей лошадкой (аспирантом) в шведской лаборатории, занимавшейся люминометрическим определением пирофосфата. Под чутким руководством неспешных шведов быстро довёл до работоспособного состояния технологию пиросеквенирования и защитил на этом диссертацию.

Шведы продолжили ковыряться с планшетным пиросеквенированием, а американцы (454) тем временем занялись технологией параллельного пиросеквенирования, которая привела к появлению первого коммерческого геномного секвенатора GS20.

Ну, а Mostafa тем временем переметнулся в Стэнфорд и сконцентрировал усилия на совершенствовании параллельной технологии секвенирования. В прошлом году грозился всех переплюнуть, но вместо того, чтобы "плеваться", продал свою фирмочку Иллюмине за 60 млн.$.

Ну и где "амналитические выводы" ?
Что Иллумина в пиросеки решила тоже податся ?

Кто-то доказывал, что SBS нужно использовать в сочетании с пиросеквенированием. Они неплохо дополняют друг друга.

По-моему, логичнее и перспективнее внедрить reversible terminators в пиросеквенирование.

http://www.pnas.org/content/104/42/16462.full

Всем привет

Терминаторы устраняют проблемы с гомогенными повторами, но замена нативных субстратов модифицированными создаёт другие проблемы :
1. Необходимость использования "хитрых" полимераз типа "9°N polymerase (exo-)A485L/Y409V" .
2. Низкая эффективность включения модифицированных субстратов даже с такими полимеразами .
3. Значительное удорожание реагентов .

Кстати, о реагентах. В технологии Illumina терминирование обязательно, но обеспечивает его не модификация 3'-OH, а флуорофоры, соединёные с основаниями классическим способом - через 7-углерод у пуринов или 5 у пиримидинов. Правда, не все флуорофоры способны терминировать полимеразную реакцию, и не все полимеразы способны "переварить" такую модификацию, но это уже секреты фирмы .

По-видимому, именно этим и объясняется интерес Illumina к пиросеквенированию и то, что они не пожалели на приобретение разработчика этой технологии 60 млн.$ .

Мне кается , что 60 лимонов налом сильно смахивает на покупку футболистов
Так сказать - новые технологии в приобретении "научных кадров" -
можно попробовать внедрить в России

Эта "фирма рога-и-копыта" ну ясен пень оформлялась под покупку Мустафы.

Блин, кто-бы меня купил, ну хотя бы за ... 10 лимонов.

у меня тут такие "прогрессивные налоги" с научной зряплаты, что если их
применить к московским миллиардерам - Москва опустеет на следующий день

проблема в том, что Иллюмина хочет дополнить свои секвенаторы, которые дают короткие риды, пиросеквенатором типа 454, который дает относительно длинные риды. По расчетам группы Леви и Вентора для сборки генома необходимы риды не менее 170 нуклеотидов. Комбинирование дешевого "короткого чтения" с дорогим, но "длинным" пиросеквенированием- это то, что стоит сегодня на повестке дня для любой геномной лаборатории. Конечно же можно купить и 454 и Иллюмину, но последняя хочет предложить комплексное решение на своей базе. Для поиска новых популяционных или ассоциативных снипов вполне подойдет и GAII особенно в сочетании с Exon trapping, а для аккуратной сборки диплоидного генома со всеми инверсиями, делециями и амплификациями нужно более аккуратное длинное чтение...

Что она это хочет - вроде уже выяснили
хотелосъ бы шпионскую инфу об иллуминском "Пиросеке"

Для инфы, даже для шпионской, пока рановато. Если, конечно, шпион не сидит в правлении Иллумины.

Что касается длины ридов, то у SOLiD 2.0 эта проблема решается парным чтением концов фрагментов длиной от 600 до 10000 п.о., причём длину чтения они обещают довести до 50х2. Это гораздо информативнее одиночных ридов, даже длинных.

Иллюмина уже давно не делает одиночных ридов. Они делают двойные риды сейчас по 35 нуклеотидов, а к зиме доведут до 50. Проблема касается именно биоинформатики и сборки. Скоро производить данные можно будет хоть в зимбабве, а вот собирать геном и уж тем более анализировать сутевую часть будет уделом очень немногих. Относительно информации по пиросеквенированию- это будет аналог 454, вернее по принципу пиросеквенирования, а пор воплощению это будет нечто иное, использующее технологию иллюминовских шариков с адресами...

И еще. У них у всех, и у нас тоже ( я имею в виду пользователей GAII, SOLID& 454) есть около полутора лет, пока на рынок не выйдет принципиально иная технология мономолекулярного чтения и тогда всем нам придется опять искать возможность смены парка машин на Хеликосы, ПасификБио и прочие нанопоры...

От задач зависит - меня де ново сиквинячиние не волнует

Леви в приватной беседе утверждал, что просто ресеквенирования не достаточно для персональной медицины. Что мол направление участков, их копийность- важнейший фактор в развитии полигенных заболеваний... Заметьте, что у Вентера стоит 10 машин для пиросеквенирования и всего по одной Иллюмине и СОЛИДу...

меня и "персональная медицина" не волнует , "полигенные заболевания" и
без буковок могут вылезти , например метилирование буковок

Потому, что Вентер решил пересиквинячить всех бактерюх на своей жопе-
никакого отношения к полигенным наследственным болячкам он не имеет .

А вы знаете , что такое Лос Аламос и Ливермор ? Спросите у жителей Хиросимы
и Нагасаки А потом подумайте почему сиквинячиние де ново микробов у них
http://www.microbeproject.gov/index.cfm?CF...572&agency_id=1

http://www.jgi.doe.gov/

Ну и где Апплера-Селера -АБИ ?
АБИ купли Инвитроген из жалости