Уважаемые друзья!
У меня возникли определеные затруднения с ретровирусной доставкой моей конструкции. Опишу ситуацию вкратце: имеются shRNA-конструкты на векторе pSUPER.retro.puro, в том числе один, который должен работать почти гарантированно. ПРодукцию вирионов делаю в клеточной линии Phoenix Eco путем котрансфекции pSUPER с pCR-VSV-G. Заражаю клетки HeLa неразведенным супернатантом + полибрен. В итоге - тишина и никакого RNAi.
Сомнения есть следующие: 1) пакующая линия - в инструкции сказано, что нужны регулярные пасажи на антибиотике для поддержания трансгена gag-env-pol - этого не делалось ни мной, ни (как я подозреваю) теми кто дал мне линию. 2) pCR-VSV-G - из той скудной информации которую мне удалось добыть из инета при трансфекции этой штуковиной должны наблюдаться симпласты, чегог нет. 3) pSUPER - нет GFP, а потому сложно понять какова эффективность инфекции.
Чего бы я хотел у Вас всех попросить: 1) советов и рекомендаций 2) может быть пакующую плазмиду (типа клонтеховских с gag-pol и vsv-g) 3) ретровирусный вектор с маркером GFP.
Заранее спасибо за любую помощь!
 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
Ретровирусная доставка
Andrew, 17.09.2008 13:50
ship, 17.09.2008 16:01
(Andrew @ 17.09.2008 10:50)
В итоге - тишина и никакого RNAi.как смотрели собственно эффект ? Вестерн? ПЦР?
guest: Andrew , 17.09.2008 16:14
Real-time PCR на ген-мишень, и гены которые изменяют свою экспрессию опосредовано через мишень, + репортер + в данной системе происходят значительные и специфические морфологические изменения клеток (все проверено при помощи синтетических siRNA - работает)
guest: Andrew , 17.09.2008 16:17
Да, и еще пробовал в зараженных клетках увидеть вирусную мРНК (которая по идее экспрессируется с 5' LTRа) ПЦРом - тоже тишина.
chatter, 17.09.2008 20:02
1. Какое у вас молярное соотношение пакующего и основного вектора при котрансфекции? Вспомогательный вектор должены быть минимум 10х к основному, поскольку феникс сам производит мышиные белки оболочки.
2. феникса на антибиотике не держим, нормально пакует.
3. Как долго селектируете клетки пуромицином после инфекции? Сколько процентов выживает? Какую концентрацию пуромицина используете?
4. из векторов с GFP порекомендовал бы LMP. Не знаю, много ли у него преимуществ, но у нас работает как часы.
2. феникса на антибиотике не держим, нормально пакует.
3. Как долго селектируете клетки пуромицином после инфекции? Сколько процентов выживает? Какую концентрацию пуромицина используете?
4. из векторов с GFP порекомендовал бы LMP. Не знаю, много ли у него преимуществ, но у нас работает как часы.
Andrew, 17.09.2008 20:39
to Chatter:
1) не совсем понял, что вы подразумеваете под пакующим и основным вектором, пакующая конструкция ведь в фениксе? Что касается pSUPER и pCR-VSV-G, то массовое соотношение 1:1.
2) понял - наверное в этом вопросе мои опасения были напрсаны
3) Пуромицином не селектирую, по ряду причин мне это не подходитю
4) LMP это что? Карту покажете? А поделиться сможете?
1) не совсем понял, что вы подразумеваете под пакующим и основным вектором, пакующая конструкция ведь в фениксе? Что касается pSUPER и pCR-VSV-G, то массовое соотношение 1:1.
2) понял - наверное в этом вопросе мои опасения были напрсаны
3) Пуромицином не селектирую, по ряду причин мне это не подходитю
4) LMP это что? Карту покажете? А поделиться сможете?
chatter, 17.09.2008 21:07
(Andrew @ 17.09.2008 20:39)
to Chatter:1) не совсем понял, что вы подразумеваете под пакующим и основным вектором, пакующая конструкция ведь в фениксе? Что касается pSUPER и pCR-VSV-G, то массовое соотношение 1:1.
2) понял - наверное в этом вопросе мои опасения были напрсаны
3) Пуромицином не селектирую, по ряду причин мне это не подходитю
4) LMP это что? Карту покажете? А поделиться сможете?
1. Феникс ваш скорей всего мышиные векторы пакует, а всв-г кодирует гликопротеин, позволяющий вирусам заражать клетки человека, поэтому этого вектора должно быть больше, дабы создать в цитоплазме феникса избыток "правильного" белка оболочки.
3. Ну, тогда бог вам в помощь, ибо эффективность инфекции у меня 5-10%. Иногда и ниже. Отбор надо проводить только первые пару недель после инфекции. После этого при проведении краткосрочных эспериментов антибиотик добавлять не обязательно, поскольку интеграция вируса достаточно стабильна.
4. Поделиться-то могу, да больно хлопотно слать из Германии. Поспрашайте для начала вокруг, у кого-то обязательно должен быть.
Andrew, 17.09.2008 22:51
to Chatter
Спасибо Вам за ответы, хочу заметить, для меня несколько неожиданно утверждение, что эффективность инфекции может быть так мала. Вероятно у Вас какие-то сложные клетки? Первичная культура? SC? Дело в том, что для моей цели важна немедленная высокая эффективность трансфекции, из-за чего пришлось отказаться от обычной плазмидной трансфекции (с которой на HeLa я получаю как раз эти 10-15%) в пользу ретровирусов (про которые мне говорили что Хелю можно слету заинфицировать до 90%). Что касается оболочки, я в принципе понимаю о чем вы говорите, но ведь вроде как копия экотропного гена env в фениксе одна или несколько и при трансфекции плазмиды pVSV-G все равно получается жуткий избыток пантропного гликопротеина. И при чем тут тогда соотношение pSUPER и pVSV-G (напомню что env таки не на pSUPER, а в хромосомах Феникса).
Спасибо Вам за ответы, хочу заметить, для меня несколько неожиданно утверждение, что эффективность инфекции может быть так мала. Вероятно у Вас какие-то сложные клетки? Первичная культура? SC? Дело в том, что для моей цели важна немедленная высокая эффективность трансфекции, из-за чего пришлось отказаться от обычной плазмидной трансфекции (с которой на HeLa я получаю как раз эти 10-15%) в пользу ретровирусов (про которые мне говорили что Хелю можно слету заинфицировать до 90%). Что касается оболочки, я в принципе понимаю о чем вы говорите, но ведь вроде как копия экотропного гена env в фениксе одна или несколько и при трансфекции плазмиды pVSV-G все равно получается жуткий избыток пантропного гликопротеина. И при чем тут тогда соотношение pSUPER и pVSV-G (напомню что env таки не на pSUPER, а в хромосомах Феникса).
chatter, 18.09.2008 20:50
(Andrew @ 17.09.2008 22:51)
to ChatterСпасибо Вам за ответы, хочу заметить, для меня несколько неожиданно утверждение, что эффективность инфекции может быть так мала. Вероятно у Вас какие-то сложные клетки? Первичная культура? SC? Дело в том, что для моей цели важна немедленная высокая эффективность трансфекции, из-за чего пришлось отказаться от обычной плазмидной трансфекции (с которой на HeLa я получаю как раз эти 10-15%) в пользу ретровирусов (про которые мне говорили что Хелю можно слету заинфицировать до 90%). Что касается оболочки, я в принципе понимаю о чем вы говорите, но ведь вроде как копия экотропного гена env в фениксе одна или несколько и при трансфекции плазмиды pVSV-G все равно получается жуткий избыток пантропного гликопротеина. И при чем тут тогда соотношение pSUPER и pVSV-G (напомню что env таки не на pSUPER, а в хромосомах Феникса).
Прошу прощения, был небрежен в терминологии, под "белком оболочки" имел в виду конечно гликопротеин. На счет его жуткого избытка при трансфекции я не уверен, сам не мерял, но шеф посоветовал брать вспомогательного вектора побольше. Эффективность у нас низкая видимо потому, что работаем без полибрена. В контексте вашей проблемы подытожу:
-необходим контоль инфекции (GFP)
-хорошо бы поиметь конструкцию, которая не почти гарантированно, а 100% дает нокдаун, поскольку, сами понимаете, даже идеально склонированная шпилька может не дать никакого эффекта.
-все-таки грохните феникса антибиотиком, бог знает, сколько его без селекции держали.
-ну и наконец, если вам надо быстро и дешево вырубить ген в 100% клеток, можно запихнуть вашу шпильку в вектор с tet-индуцибельным промотором.
Удачи.
Andrew, 18.09.2008 21:28
chatter, спасибо Вам за советы. Осталось найти кого-нибудь кто даст мне а) вектор с GFP, б) индуцибельный вектор, в) очень желательно новый пакующий вектор, на случай если проблема в фениксе. Так что тема по-прежнему открыта.
morbid, 19.09.2008 21:44
если у вас есть опыт обычной молекулярки
то вставить gfp вместо puro вы и сами можете
судя по сиквенсу плазмиды это работы на неделю
то вставить gfp вместо puro вы и сами можете
судя по сиквенсу плазмиды это работы на неделю
Nameless, 19.09.2008 22:19
На HeLa с Fugene HD я получал на глазок 70-80% эффективность трансфекции контрольной плазмидой с b-gal. Может, вам просто сменить реагент?
Andrew, 19.09.2008 23:53
morbid, я об этом уже думаю. Что касается опыта, то как раз в "обычной молекулярке" он значительный, а в ретровирусно-клеточных делах пока маловато. Просто лень было делать лишнюю работу, если кто-то вдруг даст нужную плазмидку. Но ситуация складывается так, что похоже придется лепить этот самый конструкт.
nameless, у меня Polyfect от Qiagen. Я уже понял что это полное г.., но особенности обеспечения в моей лаборатории не позволяют вдруг быстро купить другой реагент. На будущее буду знать конечно. Кстати Квиагеновский реагент Hiperfect для доставки siRNA оказался на удивление хорош.
nameless, у меня Polyfect от Qiagen. Я уже понял что это полное г.., но особенности обеспечения в моей лаборатории не позволяют вдруг быстро купить другой реагент. На будущее буду знать конечно. Кстати Квиагеновский реагент Hiperfect для доставки siRNA оказался на удивление хорош.
Nameless, 20.09.2008 00:35
А какая у вас эффективность с Hiperfect и как проверяли? Не поделитесь протоколом для HeLa?
guest: Andrew , 22.09.2008 14:30
Эффективность порядка 70-80%, протокол обычный из мануала.
morbid, вот я все-таки взялся за клонирование и хочу Вас спросить как спеца по ретровирусам: нужно ли вставлять CMV-промотор вместе с GFP или достаточно того уровня транскрипции, который обеспечивается 5'LTRом. Терминатор (поли-А сигнал) насколько я понимаю не нужен, так?
morbid, вот я все-таки взялся за клонирование и хочу Вас спросить как спеца по ретровирусам: нужно ли вставлять CMV-промотор вместе с GFP или достаточно того уровня транскрипции, который обеспечивается 5'LTRом. Терминатор (поли-А сигнал) насколько я понимаю не нужен, так?
watchesbiz, 04.01.2022 06:22
denisbeta, 12.06.2023 01:20
Ottomax+ (Europe)
2
Ufa1688, 12.06.2023 07:30
When I started to work with Terry there were only maybe 10 or 15 photographs that he showed in exhibitions Morgan said. Now we have over 400 of his photographs in circulation around the world out of a million-plus negatives. It’s such a rich archive.” He added “There will be a never-ending supply of new and unseen Terry O’Neills to come.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.