последнее время поставляют некачественную полимеразу - недовольны не только наши сотрудники, но и коллеги из др мест. Где вы покупаете полимеразу, чтобы к ней не было претензий, - хорошую?
особенно если есть такие места в питере..

Силекс, Евроген, Бионем, Изоген... Правда это в Москве

Дилат, Москва
Воронин Михаил Васильевич
499 613 2362

Диалат!

http://www.molbiol.ru/forums/lofiversion/i....php/t7396.html

Кстати, о полимеразе.

Кто поставляет KlenTaq? Но только не "обрубок" с пониженной термостабильностью, а мутантную форму, которая хорошо держит температуру. И желательно с горячим стартом. А то уже надоело выискивать бесшпилечные зоны при расчёте праймеров.

А у Матвеича какой (какие) А в лабе Матвиенко в ПУщине какой? Ты же все знаешь, Генсек!

Плохому танцору ...

Думаю, что в Москве "на заказ" Клентаку могут поставить многие фирмы включая и Диалат, но источник фермента вероятно будет один и тот же
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=M...=/sdarticle.pdf

Вот именно, а Генсек видно только что родился.

а ты посади шпильку прям на праймер чтоб клентаку в ступпор вогнать

Садист.

У Матвеича KlenTaq брал. Правда, давненько это было. Ещё при социализме . Работала очень неплохо. Брал и в других местах, но нарывался на нестабильную .

Матвиенко весной похоронили. Очень жаль. Таких людей не много. Надеюсь, что в его лаборатории жизнь ещё теплится, но дойти до соседнего института всё как-то не соберусь.

За наивность вопроса прошу прощения . Просто неоднократно убеждался, что на этом форуме чем наивнее вопрос, тем больше можно получить полезной информации .

Конечно, и проще, и надёжнее обратиться к Матвеичу. Скорее всего, так и сделаю. Но что мешает забросить удочку и в этой заводи? То, что мне уже стыдно учиться?

"Антон Палыч Чехов Как-то раз заметил,
Что умный любит учиться, а дурак учить."
.................................................. Б. Окуджава

ну да

Два фореза один сделан вчера другой сегодня. Оба - PCR c плазмидной ДНК (4,7 kb + 1 kb insert). Первый - pfx platinum (Invitrogen), второй - taq (Fermentas). Первая, вторая дорожки - праймеры фланкирующие ORF, третья - 217 нуклеотидная последовательность внутри ORF, пятая - vector sequencing primers от поставщиков (фланкируют вставку на расстоянии ~100 bp от 5' и 3' концов соответственно) Что мне понятно - бенд на 3й дорожке, отсутствие продукта на 1, 2 (думаю можно найти объяснения - условия реакции, праймеры...) и 4й дорожках. Что вызывает сомнения, но объяснимо - бенд в ~ 200-300 bp на пятой (видимо часть ДНК - вектор не несущий вставки, но где тогда вставка?). Чего не понимаю - полосы в ~ 8 000, 10 000 и > 10 000 на каждой дорожке (исходная ДНК? чего такая большая?) На втором форезе видны полосы в районе 1000 нуклеотидов - нужный продукт, наряду с этим присутствует неспецифика...причем во всех случаях, включая и заводские праймеры к вектору. Хотелось бы услышать ваше мнение.

P.S.: Не думайте пожалуйста, что я пытаюсь решить свои проблемы за счет других - мне просто действительно интересно что это - некачественная полимераза, кривые руки (это можно не обсуждать, подразумеваю это по умолчанию), плохое знание вопроса (без вопросов))) или еще что-то, о чем я не подумал.

Если и Fermentas с хот-стартом, остается грешить на праймеры, особенно на секвенирующие, они точно не для ПЦР (и кто их, таких уродов, выбирал всегда поражаюсь).
Плазмиду надо брать очень мало, доли пикограммов.
Ситемы буферные разные и, соответственно, Т отж. разная. У Pfx явно ниже нормы.
Иногда ОДИН праймер в ПЦР дает полосы больше 10 кб ... в чистой воде.
До клонирования праймеры с рамки работали?

Спасибо за ответ. Нет, Fermentas без хот-старта. С плазмидой видимо вышел перебор...)) У pfx т. отж. 55 град. Честно говоря, я был очен удивлен тем, что она не работает. Причем не только у меня. Первый "тревожный сигнал" поступил от коллеги - она делала ПЦР с pfx c праймерами которые давали нужный продукт с pfu и taq получила шмер, без каких-либо признаков продукта. С рамки работали только контрольные праймеры, те что на обоих форезах дают полосу в 217 бп. Остальные - нет. Собственно, я грешил на то, что неправильно их подобрал, и они не работают. Однако на втором форезе, насколько могу видеть сработали оба. Меня очень взволновал)) тот факт, что "ОДИН праймер в ПЦР дает полосы большие 10 кб...в чистой воде" Магия? Как это объяснить? Тем более, на всех дорожках полосы идентичные. Хотя их положение на разных форезах - разное. Не понимаю если честно.

Pfx как и любая другая полимераза из археобактерий вещь капризная, и использование этой и подобных полименаз связано с некоторыми тонкостями. Поэтому если нет крайней необходимости - используйте Taq (в Вашем случае нужен еще ХотСтарт и/или бетаин 1,5-2М). Если нужна высокая точность синтеза, то вместо Pfx можно попробовать Phusion (NEB) или Tersus (Evrogen). Tersus кстати делает ХотСтарт да и цена у него дружелюбнее будет.

Никакая не магия, а побочные реакции "неспецифические", которые идут по неведомому механизму, отличному от ПЦР. Кстати, картинки будут другие, если ПЦР поставите на быстрых циклерах.
Рекомендую поставить ПЦР с 1 М бетаином. Возможно при этом придется снизить Т отж., на 2-4 оС

Килобаза прав.

Спасибо огромное за исчерпывающую информацию. О betaine недавно как раз прочел, но еще не использовал. Phusion в лабе есть. Попробую с ним. Да я еще хотел уточнить по поводу вот этой фразы "...особенно на секвенирующие, они точно не для ПЦР (и кто их, таких уродов, выбирал confused.gif всегда поражаюсь)..." Я правильно понимаю - это значит что качество этих праймеров как правило низкое, т.е. в большинстве случаев? Спасибо.

e.coli все-таки ОН.
"Качество" - не совсем верное вырвжение. Состав или, как говорят по-модному, дизайн не тот - 3-штрих концы праймеров очень сильно насыщены GC. Даже программа не выбрала бы такие праймеры.

Ну да, хотелось избежать выражения "дизайн". А в остальном, вы как в секвенатор глядели)))

e.coli, Вам готовые ПЦР мастермиксы под Ваши праймеры и матрицу нужны? Если Вы в России, отправлю. Получите через пару дней.

Нет, я не в России. Но все -равно спасибо)))

И как Phusion? Помог? или один шмер нарисовал?

Коллеги, где бы найти концентрации реагентов в мастермиксе Roche "Light Cycler Fast Start DNA Master (plus) SYBR Green 1" ?- BSA определить нетрудно, если концентрация фирмой не сообщалась, но сколько там SYBRа, нуклеотидов и единиц фермента?
Хочу попробовать смесь без UTP, потому что два из моих MAGE-сиквенсов амплифицируются с UTP куда хуже, чем со "стандартной" смесью - а другие праймеры искать проблематично из-за большой гомологии среди MAGE.

Боюсь, что нигде.

-
А какой-нибудь проверенный мастер микс с SYBR Green 1 есть на примете для Light Cycler 2.0? - чтобы со стандартными нуклеотидами, без УТФ, и желательно c модифицированной hotstart полимеразой, а не заингибированной антителами ( у меня в реакционной смеси ДМСО - у антител, как утверждается в сопроводиловке, это снижает аффинность ).

https://replicawatches24.tumblr.com/post/64...lica-watches-uk
https://ello.co/replicawatchesuk/post/ubut9ig9g4glx-q6nyphka
https://www.evernote.com/shard/s451/client/...%2BWatches%2BUK
https://www.bloglovin.com/@rolexrelicawatch...replica-watches
https://www.designspiration.com/watcheshutuk/saves/
https://write.as/fakerolexwatches/hints-to-...lica-watches-uk
https://www.dailystrength.org/journals/hint...lica-watches-uk
https://issuu.com/replicawatchesuk/docs/dif...he_replica_watc
https://www.keepandshare.com/discuss2/5601/...lica-watches-uk
https://penzu.com/public/9e250377
https://bestreplicawatc.livejournal.com/336.html
https://www.pearltrees.com/replicawatchesuk/item349627941
https://www.intensedebate.com/people/watches24
https://anonfiles.com/N039Qf66q9/Guide_On_H...atch_Online_pdf

Реальное похудение
Похудеть без голоданий и ночных перекусов
Сжигание жира и калорий Тамбов
Главная цель похудеть

Денис Яковлев Москва Продюсер
Денис Яковлев Тамбов Продюсер


+

https://twitter.com/denisyakovlev68/status/...158217276358688


Денис Яковлев
Денис Яковлев | Официальная группа
Доставка цветов, букетов, роз, Тамбов
Зарегистрируйтесь, чтобы просматривать сообщество
Секс знакомства Тамбов
Татаново


botox, drága eljárások és műtétek nélkül
botox, fără proceduri și intervenții chirurgicale scumpe

ELLESSE CREAM – forradalmian új őssejteken alapuló bőrkrém, természetes arcfiatalítás sejtközi szinten
ELLESSE CREAM – cremă revoluționară de piele pe bază de celule stem, întinerire naturală a feței la nivel intercelular

เพิ่มขนาดอวัยวะเพศ
เพิ่มขนาดอวัยวะเพศ

Comandă Vormixil de la Centrul Privat de Parazitologie cu reducere
varicele la femei

ช่วยดูแลและฟื้นฟูการทำงานของต่อมลูกหมากอักเสบ
ผู้ชายในประเทศนี้รักษาต่อมลูกหมากอักเสบได้ภายใน 2 สัปดาห์! รักษาหายภายในครั้งเดียวและไม่กลับมาเป็นอีก รู้ไหมว่า

greenherb
ผลิตภัณฑ์ลดน้ำหนักสำหรับท่านชาย
ลดน้ำหนัก อย่างไม่เป็น อันตราย

diaxil
Nuevo producto para la diabetes tipo 2 disponible en España
[url=https://bloghealthy.press/diaxil/es/v1/?geo=46846&flow_id=awbfxpt5z5&click_id=wfpuBiHzRB&sub1=sub1&sub2=sub2&sub3=sub3&sub4=sub4&sub5=sub5&facebook=&pl=6567&lp=8980]Producto natural que normaliza
el nivel de glucosa en la sangre[/url]

preparaciones naturales para reducir los niveles de azúcar en sangre
La diabetes tiene solución

Denis Yakovlev seo
Доставка цветов в Тамбове

I metodi di trattamento delle malattie articolari in Italia
Die Methoden in Deutschland zur Behandlung von Gelenken
Eyeon
Bitokal Active

Ocularix
Възстановява зрението на 99% за 1 курс на употреба
Ocularix

Internet marketer Denis Yakovlev Moscow

HondroStrong, prezzo, funziona, recensioni, opinioni, forum, Italia
Hondrostrong crema per la lotta contro il dolore alle articolazioni, l’artrite e l’artrosi
Hondrostrong

+
Доставка цветов в Тамбове

Cystinorm (Europe)
Soluzione istantanea per la cistite
¿Cómo curar pasivamente la cistitis?
La cistite non se ne va da sola, e non si cura con gli antibiotici
l’incontinenza femminile
Switzerland Blasenentzündung
Como curar a cistite?
Wie kann man Blasenentzündung schonend heilen?
In Österreich kaufen CystiNorm Sofortige Lösung der Zystitis

LA GRASA SE DISUELVE COMPLETAMENTE

增大你的阴茎，让你更持久

Знакомства Тамбов Тамбовская область без регистрации
Интернет маркетинг технологии Blogger

Знакомства Москва с фото и телефонами Московская область
Познакомится в Москве (Московская область) онлайн

Когда цена снизится бот низких цен авиабилеты авиасеилс
Подписка на цену авиабилетов aviasales

https://twitter.com/denisyakovlev68/status/...734214795726849

Авиасейлс авиабилеты дешево App Store Apple
Cheap flights — Aviasales - Apps on Google Play

+++
Il sovrappeso può rendere la vita molto difficile
Notizie attuali
Dimagrire in modo comodo
Compra CBDus+ ad un prezzo vantaggioso
Come perdere peso
pr
La tua salute maschile sta peggiorando?
La prostatite non e’ pericolosa solo per la salute, e’ pericolosa anche per la vita

Diaform+ (Europe)
Mittel zur Normalisierung des Zuckerspiegels
Diabetes: Wie bekomme ich verlorene Gesundheit zurück?
Sagen Sie "Stop" zu erhöhtem Blutzuckerspiegel
Nur ein Wunder rettete mich von hohem Blutzuckerspiegel
Beseitigt die Folgekrankheit und erleichtert das Leben mit Diabetis

Mijloace pentru normalizarea nivelului de zahăr
Zahărul ridicat din sânge - o problemă care se înrăutățește cu fiecare an
Principala concepție greșită a diabeticilor, care scurtează viața
Normalizează nivelul zahărului din sânge
Spune "stop" nivelurilor ridicate de zahăr din sânge
Verificați-vă dacă aveți semne de niveluri ridicate de zahăr din sânge?
Doar un miracol m-a salvat de zahăr ridicat
a fost luată decizia de a aloca remedii pentru terapia diabetului
O abordare inovatoare a tratamentului diabetului
Miliarde câștigate pe diabet

Город Тамбов

Gli studiosi hanno inventato un preparato per curare il diabete

Diaxil stabilizza il livello dello zucchero e normalizza il rilascio dell’insulina

Diaxil un preparato per la lotta contro il diabete
Diaxil el remedio para la lucha contra la diabetes

+
Dulcinozox
Dulcinozox - TWÓJ STABILIZATOR CUKRU
Elesse Cream Rewolucyjny krem do pielęgnacji skóry na bazie komórek macierzystych
Архив блога

Знакомства в Тамбове
Знакомства город Тамбов

999

From Myanmar app aff1688 meth and other synthetic drugs แฮนดิแคป คือ then travel out to the world เกมสล็อต with shipments previously 123goal found as far away as Japan สูตรสล็อต New Zealand and Australia. nigoal123 South Asia, too, is being ทาง เข้า ufabet มือ ถือ pulled further into this market [url=https://ufa1688.com/?p=2285&preview=true"ufabet vip[/url] with meth transported in “high volumes” from ทาง เข้า ufabet Myanmar to Bangladesh and northeast India ปั่นสล็อต the report found.

What distinguishes us as the top Ajmer Escort Service
All of our models exude a sophisticated sensuality with a soft undertone of naughtiness that is impossible to resist arousing. Words are inadequate to describe our Ajmer escorts. Pictures seldom ever do it justice, but we did our best, and you can find a high-resolution, professional portfolio for each of our lovely escorts in Ajmer in the gallery. But a good babe is more than just good looks; what fun is a date with a really attractive wet blanket who doesn't talk or interact? Only models with personality that complement their attractiveness are chosen by us. They want you to feel entirely at ease throughout your time with them, and they are skilled at both inflaming and disarming with a single glance. For the most recent developments

https://www.ramika.co.in
https://rihana.co.in/ajmer-escort

Ajmer Escorts ||
Alwar Escorts ||
Banswara Escorts ||
Baran Escorts ||
Barmer Escorts ||
Beawar Escorts ||
Bharatpur Escorts ||
Bhilwara Escorts ||
Bikaner Escorts ||
Bundi Escorts ||
Chittorgarh Escorts ||
Churu Escorts ||
Dausa Escorts ||
Dholpur Escorts ||
Dungarpur Escorts ||
Ganganagar Escorts ||
Hanumangarh Escorts ||
Jaipur Escorts ||
Jaisalmer Escorts ||
Jalore Escorts ||
Jhalawar Escorts ||
Jhunjhunu Escorts ||
Jodhpur Escorts ||
Karauli Escorts ||
Kishangarh Escorts ||
Kota Escorts ||
Nagaur Escorts ||
Nasirabad Escorts ||
Pali Escorts ||
Pratapgarh Escorts ||
Pushkar Escorts ||
Rajsamand Escorts ||
Sawai Madhopur Escorts ||
Sikar Escorts ||
Sirohi Escorts ||
Tonk Escorts ||
Udaipur Escorts ||