 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
Выделение и фиксация лимфоцитов для 3D FISH
amrita86, 27.02.2013 11:29
Знает ли кто-нибудь метод выделения (отделения от эритроцитов) и фиксации лимфоцитов из периферической крови, при котором не нарушается трехмерная структура их ядер?
more, 19.03.2013 21:08
можно сепарировать мнпк в фиколл-урографине (http://www.dna-technology.ru/files/images/instruction/Fikol(081-1)25.11.10.pdf) или в гистопаке (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/10771?lang=en®ion=RU)
вот тут обсуждалась эта тема:
вот тут обсуждалась эта тема:
semi, 24.03.2013 09:17
Про выделить - уже ответили.
Про остальное - проблема в том, что надо "приклеить" лимфоцит к стеклу, чтобы не уплыл при FISH (http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/354240_pug.pdf)? Или что-то другое беспокоит?
Про остальное - проблема в том, что надо "приклеить" лимфоцит к стеклу, чтобы не уплыл при FISH (http://www.bdbiosciences.com/external_files/dl/doc/manuals/live/web_enabled/354240_pug.pdf)? Или что-то другое беспокоит?
amrita86, 24.03.2013 09:35
в данный момент фиксировать вроде удается, проблема в том, что после фиксации FISH не проходит. видимо, зонды не могут попасть внутрь ядра. Фиксируем 10 мин в 3,7% ПФА, потом добавляем ТритонХ-100 до концентрации 0,01, выдерживаем 60 мин. В результате эритроциты лизируются. Потом уже без эритроцитов проводим пермобилизацию 5 мин в 0,5 % ТритонХ-100. Ну и потом отмыв в PBS и дегидротация в спиртах.
semi, 24.03.2013 15:54
А зонды не в 3D формате работают?
ДНК как денатурируете: кислотой?
ДНК как денатурируете: кислотой?
amrita86, 10.04.2013 12:16
(semi @ 24.03.2013 16:54)
А зонды не в 3D формате работают?ДНК как денатурируете: кислотой?
При метанольно-уксусной фиксации зонды прекрасно работают, проблема именно в ПФА.
во время FISH денатурируем формамидом при температуре
Дядя ФАКСер, 10.04.2013 12:34
(amrita86 @ 27.02.2013 10:29)
Знает ли кто-нибудь метод выделения [/u]?MACS, untouched, whole blood isolation kit
semi, 10.04.2013 14:38
А чем вы фиксируете лимфоциты на стекле?
amrita86, 10.04.2013 16:05
(semi @ 10.04.2013 15:38)
А чем вы фиксируете лимфоциты на стекле?вся фиксация идет в пробирках, на стекло я просто раскапываю и даю высохнуть
Pharmaсol, 10.04.2013 17:26
semi, 11.04.2013 10:33
(amrita86 @ 10.04.2013 17:05)
вся фиксация идет в пробирках, на стекло я просто раскапываю и даю высохнутьНасколько можно говорить о сохранности 3D-структуры, если клеткам дать высохнуть? Насколько PFA может удержать 3D-структуру ядра , если убрать воду? Что-то терзают сомнения...
Правда, всё равно не понятно, почему нет FISH-сигнала. Его совсем-совсем нет, или всё-таки есть неспецифическое связывание?
amrita86, 11.04.2013 10:49
ну вроде стандартная методика 3D фиксации в ПФА...
все ядро (окрашено DAPI) светится в цветах зондов, неспецифическое связываение, думаю, есть, но ни одного сигнала ((
хотя, посмотрела сейчас... оно светится во всех каналах, даже тех, где нет зондов. так что это, видимо, просто свечение ядра, а не проникновение зондов (((
все ядро (окрашено DAPI) светится в цветах зондов, неспецифическое связываение, думаю, есть, но ни одного сигнала ((
хотя, посмотрела сейчас... оно светится во всех каналах, даже тех, где нет зондов. так что это, видимо, просто свечение ядра, а не проникновение зондов (((
Pharmaсol, 11.04.2013 13:39
Если DAPI красит ДНК, то проблема не в проникновении, проблема в денатурации. ПФА, в отличие от спирт-уксуса, фиксатор т.н. cross-linking и гистоны не вымывает, что требует особых условий денатурации
При метанольно-уксусной фиксации зонды прекрасно работают, проблема именно в ПФА.
во время FISH денатурируем формамидом при температуре
при какой?
(amrita86 @ 10.04.2013 13:16)
При метанольно-уксусной фиксации зонды прекрасно работают, проблема именно в ПФА.во время FISH денатурируем формамидом при температуре
при какой?
watchesbiz, 07.12.2021 14:49
denisbeta, 11.06.2023 00:04
Parazol [HR]
Hyper caps [HU]
KETON AKTIV [CH]
ProBiotic Slim [CH]
Hemoroclear [RS]
Vernarex [TH]22
11
22
33
ro
Money Amulet [TH]3-1
Money Amulet [TH]4-1
Money Amulet [TH]5-1
Money Amulet [TH]6-1
Money Amulet [TH]7-1
Diacard th_TH v3
Артропан [RS]11
Vormixil Espania
Thailand
Thai shop
+
Hyper caps [HU]
KETON AKTIV [CH]
ProBiotic Slim [CH]
Hemoroclear [RS]
Vernarex [TH]22
11
22
33
ro
Money Amulet [TH]3-1
Money Amulet [TH]4-1
Money Amulet [TH]5-1
Money Amulet [TH]6-1
Money Amulet [TH]7-1
Diacard th_TH v3
Артропан [RS]11
Vormixil Espania
Thailand
Thai shop
+
Ufa1688, 16.06.2023 10:10
From Myanmar meth and other synthetic drugs then travel out to the world with shipments previously found as far away as Japan New Zealand and Australia. South Asia, too, is being pulled further into this market [url=https://ufa1688.com/?p=2285&preview=true"ufabet vip[/url] with meth transported in “high volumes” from Myanmar to Bangladesh and northeast India the report found.
jaipurescorts0010, 16.06.2023 11:07
female. Our females are all very skilled and passionate about what they do.
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
||
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.