Коллеги, помогите, пожалуйста, не могу сообразить, как организовать положительный контроль обработки ДНК бисульфитом.
Заранее благодарю.
 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
Бисульфитное секвенирование ДНК
ПеченьКо, 22.03.2013 13:17
petr, 22.03.2013 20:58
CpG methyltransferase Вам в помощь, речь идет о CpG метилировании.
Кстати, SAM нестабилен, разальквотьте и исрользуйте по одному разу.
Кстати, SAM нестабилен, разальквотьте и исрользуйте по одному разу.
semi, 24.03.2013 09:08
Если у Вас не растения и не ЭСК, то метилируются цитозины в CpG контексте, все остальные при бисульфитной конверсии должны быть конвертированы в T. Процент конвертированных цитозинов вне CpG контекста является мерой качества бисульфитной обработки. Обычно ставят порог в 95% конвертированных C.
ПеченьКо, 25.03.2013 09:50
Спасибо большое за советы, у меня ДНК раковых клеток.
ПеченьКо, 25.03.2013 10:17
Еще вопрос, при клонировании исследуемых участков, примерно какое количество клонов достаточно секвенировать ,чтобы быть уверенной в полученных данных?
semi, 25.03.2013 15:52
Это от Ваших возможностей зависит и от наблюдаемой вариабельности, но обычно в статьях приводят не менее 10 отсеквенированых последовательностей.
akatar, 25.03.2013 17:54
Учтите еще только, что бывают ситуациии, особенно с GC-богатыми последовательностями, когда в целом последовательность вполне успешно конвертировалась, но на ней есть локальный участок неконверсии - это из-за тугоплавкой шпильки. Реакция конверсии ведь идет на одноцепочечной ДНК - и если при температуре реакции конверсии где-то на ДНК существует достаточно крепкая шпилька, то и конверсия в зоне этой шпильки будет за труднена или вообще не пройдет.
Если у Вас бисульфитное сиквенирование, и такой вот участок локальной неконверсии окажется в зоне прочтения, между праймерами - то по сиквенсу его будет видно, по неконвертированности С, которые не в CG-сайтах. Если интересующие Вас CG-сайты лежат за пределами этого участка, и вблизи них с конверсией все в порядке - то этой локальной неконверсией можно спокойно пренебречь.
Если вам все-таки надо определить статус тех CG-сайтов, которые попадают на этот участок неконверсии - то можно побороться с проблемой:
1)порезать ДНК подходящими рестриктазами, чтобы облегчить ее денатурацию; а если получится, то и отрезать часть самой шпильки
2) ужесточить условия конверсии: более жесткую денатурацию, удлинить время конверсии. В частности, можно вести конверсию в термоциклере, по схеме с периодическими нагревами. Что-то вроде: "95 - 3-5 мин (первичная денатурация ДНК)", и затем от 10 до 30 циклов типа "95 - 1-2 мин, Т(конверсии) - 10-15 мин". Периодические нагревы до 95 временно раскрывают шпильки, - и появляется шанс, что прежде чем она захлопнется обратно при остывании до Т(конверсии), какой-то из С в ней успеет прореагировать, комплементарность в шпильке будет частично нарушена, и дальше дело с ней пойдет проще. И соответственно, чем дольше идет сама конверсия, тем и вероятность такого события выше.
Однако переусердствовать с этими нагревами и с общей продолжительностью конверсии тоже не стоит, чтобы не снизить выход реакции из-за деградации ДНК образца. В общем, надо подобрать некую оптимальную программу конверсии под свои конкретную ДНК.
Прикинуть, есть ли в зоне прочтения нехорошие шпильки при температуре конверсии можно по програмке mfold (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)
Если на участок локальной неконверсии попадает один из ваших сиквенсных праймеров - то может быть такая проблема, что конвертируете вы ДНК, пытаетесь наработать с нее ПЦР-продукт для бисульфитного сиквенирования - а он не нарабатывается, и все тут. А позитивного контроля для ПЦР нету, и возникает дилемма: то ли плохая конверсия, то ли плохие праймеры и условия ПЦР. Начинаете улучшать конверсию, проверять ее по бисульфитному сиквенсу других районов - а там все вроде в порядке, конверсия везде качественная... Пытаетесь оптимизировать ПЦР - а искомого продукта все нет. Пытаетесь чуть подвигать праймеры (причем двигаете или не тот праймер, или тот, но в пределах участка неконверсии...) - все по нулям. Да и сильно не подвигаешься: CG-сайты густо стоят, между ним не впишешься, да и длинный продукт (более 350 bp) для бисульфитного сиквенирования делать нежелательно. Такая вот может выйти патовая ситуация из-за одной недоучтеной шпильки, дающей локальную неконверсию.
Способы борьбы тут, собственно, те же: поглядеть по mfold, есть ли опасные шпильки; и если есть - подбор рестриктаз для вырезания оптимального фрагмента из ДНК, и ужесточение условий конверсиии.
Могут быть еще минимум две причины, почему с конвертиованной ДНК не нарабатывается продукт для бисульфитного сиквенирования:
1) полиморфизм, реальная пследовательность в образце не соответствует той, по какой подбирали праймеры. Это если что, по обычному сиквенсу можно увидеть.
2) шпильки на конвертированной ДНК: она хоть и вырожденная и легкопавкая, и тугоплавкие вторструктуры на ней редко встречаются - но встречаются (в частности из-за образующихся в результате конверсии длинных блоков А-Т). И попади такая шпилька на праймер или между праймерами - и ПЦР с конвертированной ДНК может и не пойти, при том, что и конверсия качественная, и с самими праймерами все в порядке. Так что и конвертированную ДНК есть смысл глядеть по mfold, по крайней мере при наличии проблем с ПЦР. Ну а как бороться с этим - можно повышать Т(отжига) чтоб попытаться расплавить шпильку (но праймеры для конвертированной ДНК обычно легкоплавкие, особо не поповышаешь); удлиннить период элонгации, чтоб дать полимеразе время таки проехать через шпильку; с присадками к ПЦР поиграться. Однако не факт, что борьба эта в итоге не закончится убедительной победой шпильки...
Если у Вас бисульфитное сиквенирование, и такой вот участок локальной неконверсии окажется в зоне прочтения, между праймерами - то по сиквенсу его будет видно, по неконвертированности С, которые не в CG-сайтах. Если интересующие Вас CG-сайты лежат за пределами этого участка, и вблизи них с конверсией все в порядке - то этой локальной неконверсией можно спокойно пренебречь.
Если вам все-таки надо определить статус тех CG-сайтов, которые попадают на этот участок неконверсии - то можно побороться с проблемой:
1)порезать ДНК подходящими рестриктазами, чтобы облегчить ее денатурацию; а если получится, то и отрезать часть самой шпильки
2) ужесточить условия конверсии: более жесткую денатурацию, удлинить время конверсии. В частности, можно вести конверсию в термоциклере, по схеме с периодическими нагревами. Что-то вроде: "95 - 3-5 мин (первичная денатурация ДНК)", и затем от 10 до 30 циклов типа "95 - 1-2 мин, Т(конверсии) - 10-15 мин". Периодические нагревы до 95 временно раскрывают шпильки, - и появляется шанс, что прежде чем она захлопнется обратно при остывании до Т(конверсии), какой-то из С в ней успеет прореагировать, комплементарность в шпильке будет частично нарушена, и дальше дело с ней пойдет проще. И соответственно, чем дольше идет сама конверсия, тем и вероятность такого события выше.
Однако переусердствовать с этими нагревами и с общей продолжительностью конверсии тоже не стоит, чтобы не снизить выход реакции из-за деградации ДНК образца. В общем, надо подобрать некую оптимальную программу конверсии под свои конкретную ДНК.
Прикинуть, есть ли в зоне прочтения нехорошие шпильки при температуре конверсии можно по програмке mfold (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form)
Если на участок локальной неконверсии попадает один из ваших сиквенсных праймеров - то может быть такая проблема, что конвертируете вы ДНК, пытаетесь наработать с нее ПЦР-продукт для бисульфитного сиквенирования - а он не нарабатывается, и все тут. А позитивного контроля для ПЦР нету, и возникает дилемма: то ли плохая конверсия, то ли плохие праймеры и условия ПЦР. Начинаете улучшать конверсию, проверять ее по бисульфитному сиквенсу других районов - а там все вроде в порядке, конверсия везде качественная... Пытаетесь оптимизировать ПЦР - а искомого продукта все нет. Пытаетесь чуть подвигать праймеры (причем двигаете или не тот праймер, или тот, но в пределах участка неконверсии...) - все по нулям. Да и сильно не подвигаешься: CG-сайты густо стоят, между ним не впишешься, да и длинный продукт (более 350 bp) для бисульфитного сиквенирования делать нежелательно. Такая вот может выйти патовая ситуация из-за одной недоучтеной шпильки, дающей локальную неконверсию.
Способы борьбы тут, собственно, те же: поглядеть по mfold, есть ли опасные шпильки; и если есть - подбор рестриктаз для вырезания оптимального фрагмента из ДНК, и ужесточение условий конверсиии.
Могут быть еще минимум две причины, почему с конвертиованной ДНК не нарабатывается продукт для бисульфитного сиквенирования:
1) полиморфизм, реальная пследовательность в образце не соответствует той, по какой подбирали праймеры. Это если что, по обычному сиквенсу можно увидеть.
2) шпильки на конвертированной ДНК: она хоть и вырожденная и легкопавкая, и тугоплавкие вторструктуры на ней редко встречаются - но встречаются (в частности из-за образующихся в результате конверсии длинных блоков А-Т). И попади такая шпилька на праймер или между праймерами - и ПЦР с конвертированной ДНК может и не пойти, при том, что и конверсия качественная, и с самими праймерами все в порядке. Так что и конвертированную ДНК есть смысл глядеть по mfold, по крайней мере при наличии проблем с ПЦР. Ну а как бороться с этим - можно повышать Т(отжига) чтоб попытаться расплавить шпильку (но праймеры для конвертированной ДНК обычно легкоплавкие, особо не поповышаешь); удлиннить период элонгации, чтоб дать полимеразе время таки проехать через шпильку; с присадками к ПЦР поиграться. Однако не факт, что борьба эта в итоге не закончится убедительной победой шпильки...
ПеченьКо, 27.03.2013 09:30
Спасибо большое Вам, akatar, за столько полезных советов, у меня это первый эксперимент, поэтому немного волнуюсь.
akatar, 02.04.2013 14:38
Ну что ж, успехов Вам в Вашем безнадежном деле!
И заодно уж еще один умный вещь скажу по поводу бисульфитного сиквенса, а то это порой как-то упускается из виду: ведь после бисульфитной конверсии смысловая и антисмысловая цепь исходной ДНК представляют собой довольно-таки различающиеся последовательности, но с одинаковыми позициями CG-сайтов. В смысловой идет замена С на Т, как положено; а вот если посмотреть, в такой же ориентации, на комплементарку к конвертированной антисмысловой цепи - то там-то получается замена G на A, а по CG-сайтам соответственно - либо CG для метилированных, либо CA для неметилированных. Т.е. - это две разные последовательности, шпильки и позиции праймеров у них довольно сильно различаются.
(для работы можно антисмысловую цепь развернуть в 3' - 5' ориентацию, и работать как обычно, с заменами С на Т)
Соответственно, это дает полезную дополнительную возможность: если та картина, что по вариантам праймерав и по шпилькам вырисовывается для конвертированной смысловой цепи, сильно не нравится, или подобранные к ней праймеры не работают, хоть убейся - то можно попробовать подобрать праймеры к конвертированной антисмысловой цепи, возможно там все окажется получше.
А вообще же, при подборе праймеров для бисульфитного сиквенса лучше сразу смотреть оба варианта, сенсный и антисенсный, и выбирать, какой выглядит более благоприятным.
И заодно уж еще один умный вещь скажу по поводу бисульфитного сиквенса, а то это порой как-то упускается из виду: ведь после бисульфитной конверсии смысловая и антисмысловая цепь исходной ДНК представляют собой довольно-таки различающиеся последовательности, но с одинаковыми позициями CG-сайтов. В смысловой идет замена С на Т, как положено; а вот если посмотреть, в такой же ориентации, на комплементарку к конвертированной антисмысловой цепи - то там-то получается замена G на A, а по CG-сайтам соответственно - либо CG для метилированных, либо CA для неметилированных. Т.е. - это две разные последовательности, шпильки и позиции праймеров у них довольно сильно различаются.
(для работы можно антисмысловую цепь развернуть в 3' - 5' ориентацию, и работать как обычно, с заменами С на Т)
Соответственно, это дает полезную дополнительную возможность: если та картина, что по вариантам праймерав и по шпилькам вырисовывается для конвертированной смысловой цепи, сильно не нравится, или подобранные к ней праймеры не работают, хоть убейся - то можно попробовать подобрать праймеры к конвертированной антисмысловой цепи, возможно там все окажется получше.
А вообще же, при подборе праймеров для бисульфитного сиквенса лучше сразу смотреть оба варианта, сенсный и антисенсный, и выбирать, какой выглядит более благоприятным.
Annie07, 21.07.2016 12:36
Здравствуйте).
Проясните, пожалуйста, пару моментов по поводу бисульфитной конверсии и секвенирования:
1)При конверсии с использованием наборов QIAGENE и др. неметилированный С конвертируется в U. В базовой статье, на которой я основываюсь при постановке эксперимента, указывается, что далее они конвертировали цепь до Т. Насколько критична эта стадия?Можно ли без нее обойтись? Будет ли полимераза распознавать U, как Т?Сядут ли праймеры предназначенные для Т, на ту цепь, которая несет U.
2)Можно ли провести бисульфитное секвенирование без предварительного клонирования?Для чего нужно клонировать фрагмент?
Проясните, пожалуйста, пару моментов по поводу бисульфитной конверсии и секвенирования:
1)При конверсии с использованием наборов QIAGENE и др. неметилированный С конвертируется в U. В базовой статье, на которой я основываюсь при постановке эксперимента, указывается, что далее они конвертировали цепь до Т. Насколько критична эта стадия?Можно ли без нее обойтись? Будет ли полимераза распознавать U, как Т?Сядут ли праймеры предназначенные для Т, на ту цепь, которая несет U.
2)Можно ли провести бисульфитное секвенирование без предварительного клонирования?Для чего нужно клонировать фрагмент?
plurgene, 21.07.2016 15:43
Никто в Т не конвертирует химически. ДНК обрабатывают бисульфитом, все неметилированные С превращаются U. Эту ДНК Вы используете в качестве матрицы для ПЦР, туда кладете обычные А, Т, С и G. Полимераза ставит против U (в матрице) А (в продукте), уже против этой А - Т. Вот Вам и конверсия. В матрице U, в продукте ПЦР - Т . Клонировать ПЦР продукт нужно чтобы отобразить ситуацию в аллелях, просто в данном случае 1 плазмидный клон = 1 аллель. Метилирование процесс не абсолютный, в одной клетке (два аллеля) или в разных (в культуре) в одной и той же позиции может быть два состояния и клонировав Вы их разделите, посмотрите каких больше. Если секвенировать по Сенгеру напрямую продукт, то можно напороться на двойные пики и там уже не разобрать, чего больше. Это можно заменить параллельным высокопроизводительным секвенированием, если оно доступно. Но обычно ПЦР продукты так не анализируют.
Guest, 14.07.2021 10:00
watchesbiz, 27.08.2021 09:42
watchesbiz, 23.10.2021 16:23
?
nigoal123, 21.12.2021 10:05
An article is written. material that is read by an audience make a wide-ranging impact on targeted readers. Articles can be written by marketing or public relations departments to communicate an organization's
thought leadership while providing relevant information linked with their industry. Some content writers may write articles within a content management system if they write them on a daily or weekly basis.
thought leadership while providing relevant information linked with their industry. Some content writers may write articles within a content management system if they write them on a daily or weekly basis.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.