 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
protein concentration
Anonymous, 15.07.2001 08:41
Rebiata, nujna ideia po izmereniu concentrasii BSA (bov.ser.alb-n). Situasia takaia: ia ximicheski adsorbiruiu BSA na poristii' material, posle reaksii i otmivania kakoe to kolichestvo BSA ostaetsia na poverxnosti por. Do six por ia izmerial polnoe kolichestvo BSA do reaksii i posle, priamim izmereniem UV Absorption dlia 280 nm. no etot metod daet neudovletvoritelnuiu oshibku, potomu chto vo pervix, adsorburuetsia malo BSA, i vo vtorix, posle otmivania concentrasia BSA v otmivochnom rastvore stanovitsia takoi', chto okazivaetsia na kraiu doveria moego spectrophotometra Cary50Bio. Concentration BSA v otmivochnom rastvore <10mkg/ml - kak gramotno izmeriaiut takie concentrasii?
Anonymous, 15.07.2001 18:51
Exclusively iz obschikh soobrazheniy mogu suggest sleduyuschie methody:
1)Fluorescence emission (Trp, Phe, Tyr)
2)Peptide bond absorbance - D205.
Good luck.
1)Fluorescence emission (Trp, Phe, Tyr)
2)Peptide bond absorbance - D205.
Good luck.
Anonymous, 16.07.2001 13:54
Что бы ответить на Ваш вопрос не хватает данных.
Уточните, в какой концентрации Вы наносите белок
и сколько его садится на сорбент. И самое главное,
что за сорбент Вы используете, и каким агентом
пользуетесь для иммобилизации белка, от этого зависит
способ добычи информации о связавшемся белке. По
выданным данным замечу, что, возможно, сорбент
не нужно промывать, а мерить прямо концентрацию белка
в растворе до реакции и после (исходный объем, умноженный на разность
концентраций даст вполне приемлемый результат). Есть тупой,
проломный вариант (с высокой чувствительностью),
правда сравнительно долгий: сорбент с белком подвергнуть
обработке, как при гидролизе белка, и снести на ближайший
аминокислотный анализатор. А для спокойствия то же самое проделать с
пустым сорбентом. Да, кстати, в предлагаемом мной первом варианте
можно использовать и др. методы определения белка (лоури, брэдфорд,
с флоурескамином (нужен флуориметр, но метод очень чувствительный)).
Они перечислены в порядке возрастания чувствительности это может
помочь справиться с низкими концентрациями. (Внимание! Все перечисленные
методы имеют свои ограничения и применять их можно не в любом случае.)
Успехов.
Уточните, в какой концентрации Вы наносите белок
и сколько его садится на сорбент. И самое главное,
что за сорбент Вы используете, и каким агентом
пользуетесь для иммобилизации белка, от этого зависит
способ добычи информации о связавшемся белке. По
выданным данным замечу, что, возможно, сорбент
не нужно промывать, а мерить прямо концентрацию белка
в растворе до реакции и после (исходный объем, умноженный на разность
концентраций даст вполне приемлемый результат). Есть тупой,
проломный вариант (с высокой чувствительностью),
правда сравнительно долгий: сорбент с белком подвергнуть
обработке, как при гидролизе белка, и снести на ближайший
аминокислотный анализатор. А для спокойствия то же самое проделать с
пустым сорбентом. Да, кстати, в предлагаемом мной первом варианте
можно использовать и др. методы определения белка (лоури, брэдфорд,
с флоурескамином (нужен флуориметр, но метод очень чувствительный)).
Они перечислены в порядке возрастания чувствительности это может
помочь справиться с низкими концентрациями. (Внимание! Все перечисленные
методы имеют свои ограничения и применять их можно не в любом случае.)
Успехов.
Anonymous, 17.07.2001 04:22
Spasibo i Olegovitchu i avor'u' za idei. Osobenno mne ponravilis misli avor'a'... Kasatelno sorbenta, to eto poristue granuli ~50 mkm, pori~0.1mkm iz methacrylate co-polymer Toyopearl seria, ot TosoHaas. Ia ispolsuiu ix kak stasionarnuiu fasu v chromatographic column. Linking poverxnosti pori s BSA idet cheres glutaraldehyde, on k neschastiu, daet zamechatelnii' pik kak raz na 280 nm, kak i BSA. Posle reaksii ostavshiesia aktivnie sites ia zakrivaiu s pomoshiu ethanolamine. Rashodi takie: na ~2ml slurry sorbenta s koncentr. ~5% wt, ia ispolzuiu ~50mg BSA, skolko BSA saditsia na poverhnost - zavisit ot vsego. Sobstvenno eto to seichas mne i interesno.
Anonymous, 17.07.2001 18:09
Мнэ-э, Совет 1) я думаю, BSA можно брать и поменьше 5-10мг.
Совет 2) Лоури с глютаром скорее всего несовместимы, поэтому
лучше в этом случае использовать осаждение белка трихлоруксусной
кислотой затем растворение в 0.1М щелочи, а потом Лоури. Это
по поводу т.н. дифференциального измерения концентрации. (все остальные
варианты, вроде, проходят(если будет избыток глютара, он может маскировать
аминогруппы по которым работают брэдфорд и флоурескамин), гидролиз может дать неудобоваримые производные
матрицы от желтого до темно коричневого цвета (насколько я знаю Toyopearl
делает свои матрицы на основе ПВС, а не ПММА , а ПВС в кислых условиях
и при высокой температуре будет деградировать, поэтому я бы использовал
солянку концентрацией 10М, но температуру не подымал бы выше 37С и на несколько
дней и под азотом обязательно или аргоном.)
Есть еще один вариант измерения непосредственно на колонке: промываешь
уже готовый(с белком) сорбент бодяжишь это дело в 50% ПЭГе
(это чтоб не оседало и рассеивалось меньше) и измеряешь поглощение
на 280 и сравниваешь с аналогичной суспензией пустого сорбента(глютар в этом случае не мешает, тк ты уже от него отмылся).
Метод не всегда надежен из-за всяких выкрутас сорбента, кроме того в твоем
случае могут мешать связи C=N(но возможно обработка боргидридом
натрия от этого спасет, если конечно она не входит в методику присоединения
белка, тогда этого делать не нужно.(Вместо ПЭГа можно использовать
глицерин или ПАА, но без биса конечно, главное чтобы они не поглощали на 280.
Дерзайте.
Совет 2) Лоури с глютаром скорее всего несовместимы, поэтому
лучше в этом случае использовать осаждение белка трихлоруксусной
кислотой затем растворение в 0.1М щелочи, а потом Лоури. Это
по поводу т.н. дифференциального измерения концентрации. (все остальные
варианты, вроде, проходят(если будет избыток глютара, он может маскировать
аминогруппы по которым работают брэдфорд и флоурескамин), гидролиз может дать неудобоваримые производные
матрицы от желтого до темно коричневого цвета (насколько я знаю Toyopearl
делает свои матрицы на основе ПВС, а не ПММА , а ПВС в кислых условиях
и при высокой температуре будет деградировать, поэтому я бы использовал
солянку концентрацией 10М, но температуру не подымал бы выше 37С и на несколько
дней и под азотом обязательно или аргоном.)
Есть еще один вариант измерения непосредственно на колонке: промываешь
уже готовый(с белком) сорбент бодяжишь это дело в 50% ПЭГе
(это чтоб не оседало и рассеивалось меньше) и измеряешь поглощение
на 280 и сравниваешь с аналогичной суспензией пустого сорбента(глютар в этом случае не мешает, тк ты уже от него отмылся).
Метод не всегда надежен из-за всяких выкрутас сорбента, кроме того в твоем
случае могут мешать связи C=N(но возможно обработка боргидридом
натрия от этого спасет, если конечно она не входит в методику присоединения
белка, тогда этого делать не нужно.(Вместо ПЭГа можно использовать
глицерин или ПАА, но без биса конечно, главное чтобы они не поглощали на 280.
Дерзайте.
Anonymous, 18.07.2001 06:46
A vot eto, v samom dele interesno, osobenno Lowry... No nachnu so vtorogo - bodiajnogo 
varianta on vigliadit poproshe, a potom Lowry. Interesno budet sravnit. Chto poluchitsia, obiazatelno napishu, mojet komu i prigoditsia. Bolshoe spasibo avor'u' za interesnie idei.
varianta on vigliadit poproshe, a potom Lowry. Interesno budet sravnit. Chto poluchitsia, obiazatelno napishu, mojet komu i prigoditsia. Bolshoe spasibo avor'u' za interesnie idei.
Anonymous, 24.08.2001 08:04
Proshel mesias, ia koe chto poproboval i problemmu s izmeremiem protein amount na slarru dlia affinity chromatography reshil, podrobnosti o problemme sm. vishe, a o reshenii nije . Odnako do Lowry tak i ne doshel 
i vot pochemu. Tak poluchilos, chto vnachale ia poproboval BCA method - rezultati prevzoshli vse ojidania i ia na nem ostanovilsia. Daje dlia takoi' izvrashennoi sistemi kak u menia - protein (BSA) sviasannii' s poverhnostiu poristoi' granuli iz polimera, BCA daet dlia koncentrasii ot 0.5 mkg/ml do 50 mkg/ml razbros ~5%, a dlia sluchaia kogda protein (BSA) prosto rastvoren v buffere ia poluchal uverenno razbros <1%. Obichno takie tochnosti dlia takix velichin daiutsia "bolshoi kroviu", kto izmerial - tot poimet.
Chto takoe etot BCA method jelaiushie mogut naiti na http://www.piercenet.com/searchcombined2.cfm - tam mnogo vsego o metode, esli est dostup k burjui'skim jurnalam, to dlia nachala mojno prochest - Smith,P.K. et al. (1985). Mesurement of protein using bicinchoninic acid, Anal.Biochem. 150,pp.76-85. Tam est dannie o neskolkix proteinax, sravnenie BCA s Lowry. Dalee, na prostorah Russii est firma Helicon Ltd. ne dalee kak vchera, ona prislala mne pismeso, o tom, chto ona mojet posposobstvovat v pokupke BCA reagent, daje kakoi'to fail proslali, vot tolko chego ia ne poimu, tak eto togo, kak eta doblestnaia firma nashla menia i moi' e-mail? nu da ladno, vo pervix eto vopros k moderatoru, a vo vtorix, informasia bila iavno v temu... Eta firma imeet WEB-page: www.helicon.ru - pishut chto oni toje vse znaiut o BCA
Esli kto stolknetsia s affinity chromatography, to izmerenia protein concentration na polymer beads posle reaksii sviasivania mojno delat s pomoshiu BCA tak:
1) calibrovka - neaktivnie (eto vajno!) beads i bufer s proteinom, BCA smes - vse v odnom flakone, poluchit seriu grafikov absorbans(562nm) ot konsentrasii protein v takoi' razbavlennoi suspenzii dlia raznix kolichestv beads (eto potom oblegchit jizn), staratsia ulojitsia v razbrose <5% dlia 5-40 mkg/ml u menia bilo ~1-3%, ne zabivaite o blank obrazse - on mojet okazatsia ochen interesnim.
2) protein grafted - stroite grafik absrb(562nm) ot amoint beads (teper oni s proteinom), ispolsuia rez. kalibrovki vitaskivaete konsentrasiu protein na beads.
Opiat, delaite izmerenia i dlia blank - prigoditsia.
Y menia, dlia BSA, poluchalos rashojdenie ~ ot 5-10% s raschetom, osnovannim na priamom izmerenii consentrasii ostavshegosia kolichestva protein v reaksionnom rastvore.
p.s. spasibo Avoru
. Odnako do Lowry tak i ne doshel i vot pochemu. Tak poluchilos, chto vnachale ia poproboval BCA method - rezultati prevzoshli vse ojidania i ia na nem ostanovilsia. Daje dlia takoi' izvrashennoi sistemi kak u menia - protein (BSA) sviasannii' s poverhnostiu poristoi' granuli iz polimera, BCA daet dlia koncentrasii ot 0.5 mkg/ml do 50 mkg/ml razbros ~5%, a dlia sluchaia kogda protein (BSA) prosto rastvoren v buffere ia poluchal uverenno razbros <1%. Obichno takie tochnosti dlia takix velichin daiutsia "bolshoi kroviu", kto izmerial - tot poimet. Chto takoe etot BCA method jelaiushie mogut naiti na http://www.piercenet.com/searchcombined2.cfm - tam mnogo vsego o metode, esli est dostup k burjui'skim jurnalam, to dlia nachala mojno prochest - Smith,P.K. et al. (1985). Mesurement of protein using bicinchoninic acid, Anal.Biochem. 150,pp.76-85. Tam est dannie o neskolkix proteinax, sravnenie BCA s Lowry. Dalee, na prostorah Russii est firma Helicon Ltd. ne dalee kak vchera, ona prislala mne pismeso, o tom, chto ona mojet posposobstvovat v pokupke BCA reagent, daje kakoi'to fail proslali, vot tolko chego ia ne poimu, tak eto togo, kak eta doblestnaia firma nashla menia i moi' e-mail? nu da ladno, vo pervix eto vopros k moderatoru, a vo vtorix, informasia bila iavno v temu... Eta firma imeet WEB-page: www.helicon.ru - pishut chto oni toje vse znaiut o BCA
Esli kto stolknetsia s affinity chromatography, to izmerenia protein concentration na polymer beads posle reaksii sviasivania mojno delat s pomoshiu BCA tak:
1) calibrovka - neaktivnie (eto vajno!) beads i bufer s proteinom, BCA smes - vse v odnom flakone, poluchit seriu grafikov absorbans(562nm) ot konsentrasii protein v takoi' razbavlennoi suspenzii dlia raznix kolichestv beads (eto potom oblegchit jizn), staratsia ulojitsia v razbrose <5% dlia 5-40 mkg/ml u menia bilo ~1-3%, ne zabivaite o blank obrazse - on mojet okazatsia ochen interesnim.
2) protein grafted - stroite grafik absrb(562nm) ot amoint beads (teper oni s proteinom), ispolsuia rez. kalibrovki vitaskivaete konsentrasiu protein na beads.
Opiat, delaite izmerenia i dlia blank - prigoditsia.
Y menia, dlia BSA, poluchalos rashojdenie ~ ot 5-10% s raschetom, osnovannim na priamom izmerenii consentrasii ostavshegosia kolichestva protein v reaksionnom rastvore.
p.s. spasibo Avoru
totosite, 18.12.2020 07:30
What I was thinking about was solved thanks to your writing.I have written on my blog to express my gratitude to you.My site is "". We would be grateful if you visit us.
totosite, 18.12.2020 07:31
I think your writing will help me, can you come to me once and help? My site is ""
totosite, 18.12.2020 07:34
How can you think of this!I am very shocked by your writing.The problem I've been thinking about for a long time has been solved at once. Thank you so much.
totosite, 18.12.2020 07:35
I am happy to visit my site and blog. Please read my article as soon as possible. I need you.
totosite, 18.12.2020 07:36
Thanks to you, my stress has been relieved. You are really great. I hope I can think like you. I hope you can help me.
안전놀이, 07.03.2021 10:47
That's a really great post. This article will surely be of great help to many people. I would like to share it on my website and see it with many people.
먹튀검증, 07.03.2021 10:47
That's a really well-organized article! Your writing is really interesting. Please continue to write a lot in the future. supports you.
bondbond, 21.03.2021 10:26
overseas spectators, saying, "I was frustrated with the holding of a full form," and "I face doubts that the event will be held.
bondbond, 21.03.2021 10:27
However, it is not known whether public opinion related to the hosting of the Olympics will improve with this decision, Kyodo News Agency evaluated. Asahi Shimbun also diagnosed with the abandonment of
watchesbiz, 27.09.2021 17:13
watchesbiz, 27.09.2021 17:13
casinosite, 26.06.2022 06:49
It's really great. Thank you for providing a quality article. There is something you might be interested in. Do you know ? If you have more questions, please come to my site and check it out!
casinocommunity, 27.08.2022 10:39
Of course, your article is good enough, casinocommunity but I thought it would be much better to see professional photos and videos together. There are articles and photos on these topics on my homepage, so please visit and share your opinions.
imbig, 27.08.2022 12:45
ที่เดิมพันง่าย จ่ายหนัก จ่ายจริง ไม่ต้องโยกเงินให้เสียเวลา ต้องที่ IMBIG เว็บกีฬาทีดีที่สุดในไทย
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.