 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
E.coli Компетентные клетки с помощью PEG.
Anonymous, 04.08.2001 02:32
Необходимы к.клетки, есть приятная методика с ПЭГОМ 3000-8000. Питался вооспроизвести, получается плохо. Может кто знает более эффективный и с малыми затратами метод или знает ньансы данного метода? Cпасибо
Anonymous, 05.08.2001 14:19
Tak eto i est' naibolee optimal'nyi metod. Vo vsyakom sluchae bol'shinstvo moikh znakomykh pol'zovalis' i pol'zuutsya imenno im. Khotya, bylo delo, i s khloridom rubidiya prigotovlyali. Tam effektivnost' do 10 v vos'moi dokhodila.
A s PEGom khorosho vykhodit na kletkakh XL-1.
Nuansy... Kletki ne doljny pererasti. Luchshe pust' men'she plotnost' budet. Nu i vsyo doljno byt' kholodnym: bufera, tsentrifujnye stakany, rotor, probirki, ta korobka kuda vy ikh slojite.... Prichyom eto vsyo doljno byt' kholodnym DO togo kak vy pristupite sobstvenno k prigotovleniu kletok.
Ne rasstraivaites', sperva ni u kogo ne poluchaetsya. Krome togo, davno podmecheno, chto u baryshen' kletki vykhodyat vsegda luchshe!
Esli "k.kletki" deistvitel'no neobkhodimy, mojet stoit poiskat' priyatnuu baryshnu?;-)
A s PEGom khorosho vykhodit na kletkakh XL-1.
Nuansy... Kletki ne doljny pererasti. Luchshe pust' men'she plotnost' budet. Nu i vsyo doljno byt' kholodnym: bufera, tsentrifujnye stakany, rotor, probirki, ta korobka kuda vy ikh slojite.... Prichyom eto vsyo doljno byt' kholodnym DO togo kak vy pristupite sobstvenno k prigotovleniu kletok.
Ne rasstraivaites', sperva ni u kogo ne poluchaetsya. Krome togo, davno podmecheno, chto u baryshen' kletki vykhodyat vsegda luchshe!
Esli "k.kletki" deistvitel'no neobkhodimy, mojet stoit poiskat' priyatnuu baryshnu?;-)
Anonymous, 06.08.2001 16:48
Я делаю так:
1. Ночную культуру (в моем случае 2 мл культуры JM109) в 200 мл LB, растить до OD600 ~ 0.3 – 0.4 (я как-то растил 3 ч, видимо, перерастил; однако клетки получились). Как показал опыт, хороший результат при соотношении ночная культура : среда 1:100 дает 2-х часовой подрост клеток; OD600 при этом достигает 0.35.
2. Охладить колбу 15ґ на льду, далее все манипуляции тоже на льду.
3. Осадить клетки 15ґ 3500 rpm, ротор JA-14; супернатант стерильно убрать.
4. Ресуспендировать осадок в TSS буфере, ~ 5% от начального объема культуры (я брал на 200 мл LB 7 мл TSS).
Состав буфера TSS:
LB + 10% PEG Mr 6000 (wt/vol),
5% DMSO, 50 mM MgCl2, pH = 6.5
Например:
Среда LB 10 мл
PEG Mr 6000 1.15 г
1 M MgCl2 0.575 мл
DMSO 0.575 мл
Стерилизовать через фильтр.
5. Оставить суспензию на льду на 10ґ.
6. Расфасовать аликвоты по 200 мкл, в азот и на -70є С.
Получается нормально.
1. Ночную культуру (в моем случае 2 мл культуры JM109) в 200 мл LB, растить до OD600 ~ 0.3 – 0.4 (я как-то растил 3 ч, видимо, перерастил; однако клетки получились). Как показал опыт, хороший результат при соотношении ночная культура : среда 1:100 дает 2-х часовой подрост клеток; OD600 при этом достигает 0.35.
2. Охладить колбу 15ґ на льду, далее все манипуляции тоже на льду.
3. Осадить клетки 15ґ 3500 rpm, ротор JA-14; супернатант стерильно убрать.
4. Ресуспендировать осадок в TSS буфере, ~ 5% от начального объема культуры (я брал на 200 мл LB 7 мл TSS).
Состав буфера TSS:
LB + 10% PEG Mr 6000 (wt/vol),
5% DMSO, 50 mM MgCl2, pH = 6.5
Например:
Среда LB 10 мл
PEG Mr 6000 1.15 г
1 M MgCl2 0.575 мл
DMSO 0.575 мл
Стерилизовать через фильтр.
5. Оставить суспензию на льду на 10ґ.
6. Расфасовать аликвоты по 200 мкл, в азот и на -70є С.
Получается нормально.
Anonymous, 06.08.2001 19:42
Спасибо Vlad2 за ваши любезныи ответы. Каковы параметры приятной баришни? Сами понимаете клетеи-клетками но и о себе надо подумать.
А если серьезно... Может вы знаете Фирмы производители реактивов... Какой фирмы лучше ПЭГ и мол. массы и.т.п.
А если серьезно... Может вы знаете Фирмы производители реактивов... Какой фирмы лучше ПЭГ и мол. массы и.т.п.
Anonymous, 07.08.2001 14:06
Kupite TSS u "Epicentre" i ne morochte sbe golovu.
U nas nekotorye uje paru let im pol'zuutsya. 10 v shestoi - garantirovano, inogda 10 v sed'moi vykhodit.
http://www.epicentre.com/catalog/tss.htm
Khotya ya lichno predpochitau kletki ot "Stratagene".
Leni matushka... ;-)
U nas nekotorye uje paru let im pol'zuutsya. 10 v shestoi - garantirovano, inogda 10 v sed'moi vykhodit.
http://www.epicentre.com/catalog/tss.htm
Khotya ya lichno predpochitau kletki ot "Stratagene".
Leni matushka... ;-)
Anonymous, 03.09.2001 19:45
Очень важно OD (600nm), но тоже - в зависимости от штамма клеток. если смотреть на кривые, то наибольшая компетентность (для штамма XL10 Gold, Stratagene ) наблюдается при 0,300-0,380, далее спад, и очень короткий пик при OD600 = 0,9. в то же время штамм JC 8672 не подчиняется такому правилу.
Anonymous, 12.09.2001 18:37
stask, расскажите пожалуйста как вы проводите дальнейшую трансформацию плазмидой. Вы избавляетесь от ПЕГа?
Anonymous, 16.09.2001 16:21
Нет, а зачем? Ни ПЭГ, ни ДМСО мне вроде не мешают.
Трансформирую как все:
1. Клетки оттаиваю во льду ~20ґ;
2. К 100-200 мкл клеток добавляю плазмидку, если пере- , или 1/2 лигазной смеси (у меня это 7-10 мкл), если трансформация;
3. ДНК+ клетки держу 20-30ґ на льду;
4. Шок +42єС 90ґґ, затем охлаждаю ~3ґ на льду;
5. Добавляю 4 объема (т.е. 400-800 мкл) среды (LB или 2YT), и на 30ґ на +37 єС (можно с качанием, можно и без);
6. Затем на чашку с антибиотиком. Миллилитр сохнет долго, можно уменьшить объем: открутить клетки 2000 rpm 5ґ (если обороты регулируемые) или на 14000 rpm 30ґґ (если нет), убрать 800 мкл, в оставшихся 200 мкл нежно рассуспендировать сэмплером (пальчиком не получается) осадок клеток – и на чашку.
7. Вроде все.
Всех благ!
Трансформирую как все:
1. Клетки оттаиваю во льду ~20ґ;
2. К 100-200 мкл клеток добавляю плазмидку, если пере- , или 1/2 лигазной смеси (у меня это 7-10 мкл), если трансформация;
3. ДНК+ клетки держу 20-30ґ на льду;
4. Шок +42єС 90ґґ, затем охлаждаю ~3ґ на льду;
5. Добавляю 4 объема (т.е. 400-800 мкл) среды (LB или 2YT), и на 30ґ на +37 єС (можно с качанием, можно и без);
6. Затем на чашку с антибиотиком. Миллилитр сохнет долго, можно уменьшить объем: открутить клетки 2000 rpm 5ґ (если обороты регулируемые) или на 14000 rpm 30ґґ (если нет), убрать 800 мкл, в оставшихся 200 мкл нежно рассуспендировать сэмплером (пальчиком не получается) осадок клеток – и на чашку.
7. Вроде все.
Всех благ!
Anonymous, 02.10.2001 00:40
Трансформирую без +42 шока и без подроста (при селекции на amp). С подростом эффективность почему-то меньше раз в 5.
Все остальное то-же что у stask.
Все остальное то-же что у stask.
Anonymous, 30.11.2001 21:25
В данной методике температурный шок не обезателен. А вот час подроста необходим для селекции с антибиотиком
IAM1688, 26.10.2021 11:40
I used to suck at writing, big time! So I understand the struggle. However, I had a lot of help to improve my writing and blogging skills and I want to pay it forward to help those who had the same struggles I did! The aim of an article is usually to talk about a topic that we like or that we are familiar with. Besides, one of the features that articles have as opposed to other FCE Writing tasks is that an article must entertain the reader and, almos always, recommend the thing we are talking about.
watchesonline89, 25.12.2022 09:29
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.