КрисперКасп вопрос

право тупой вопрос, но непонятно мне

Есть тут у нас специалист по Крисперу с каспом? Мне тут надо проект с ним начинать, Интернет читал-читал ... только голову себе замутил.

У меня конкретные вопросы есть. Для конструкции версии вектора адаптированного к нашим задачам. У нас тут еще и особенности есть некоторые ... не всем может понятные , так что не спрашивайте зачем оно мне и не давайте ссылки на учебники. Лучше на статьи ссылки.

Так вот .. меня интересует вот этот участочек между первыми 20 нуклеотидами которые таргетируют разрыв рядом с [NGG] сайтом на целевой ДНК и остальной частью [sgRNA] .. Могу я там что-то поменять? Ну скажем вставить сайт [EcoRV] .. И если могу, то что лучше , добавить эти 6 нуклеотидов на стык или заменить те что там есть не меняя при этом общую длину.

Вот мне уже сказали из собственного опыта люди что лишняя некомплементарная [G] в самом начале [sgRNA] вполне допустима , все работает и с ней. А она нужна для старта транскрипции этой РНК полимеразой 3, с промотора [pAtU6-26], совершенно инвариантное начало.
Вот даже самом у странно , вроде такой элементраный вопрос а не могу нагуглить ответ на его. максимум что нашел так это вот что мисматчи ближе к [NGG] вроде как слабо влияют на процесс.. Но что будет если я добавлю просто несколько нуклеотидов между спэйсером и скаффолдом или заменю их в конце скаффолда все равно непонятно. Насколько этот Кас критичен к точности РНК своей в области между 20-концом и инвариантной частью? Может ему вообще неважно , поэтому никто и не заморачивается.

Cas9 will only cleave a given locus if the gRNA spacer sequence shares sufficient homology with the target DNA. Once the Cas9-gRNA complex binds a putative DNA target, the seed sequence (8-10 bases at the 3′ end of the gRNA targeting sequence) will begin to anneal to the target DNA. If the seed and target DNA sequences match, the gRNA will continue to anneal to the target DNA in a 3′ to 5′ direction. Thus, mismatches between the target sequence in the 3′ seed sequence completely abolish target cleavage, whereas mismatches toward the 5′ end distal to the PAM often still permit target cleavage.

in DNA , 5' -gN20 - gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-ttttttt-ctaga

EcoRV 5'-GAT|ATC-3'

вот нашел вроде нужную работу , читал-читал , так и не понял ничего ... Так можно или нет вставить 6 нуклеотидов между гайдом и скаффолдом?

https://www.cell.com/fulltext/S0092-8674%2814%2900156-1#fig4


Просветите меня люди понимающие в теме... Я уже старенький стал , мне сложно вот так на ходу во всем разбираться. Мне конкретный ответ нужен. Ну или хотя бы некое логичное умозаключение из вышеприведенного исследования.

вот это самое ГТТТТ явно менять нельзя , оно там вторичную структуру создает , шпильку делает которая скорее всего необходима для работы.

Ну а что если всю шпильку поменять ? сделать скажем [gatatc] вместо [gtttta] и в соответствующем месте там чуть далее поставить тоже [gatata] например Что там эта шпилька обязана быть именно [TTTTA/taaaa] ? Иначе [Cas9] ее и не признает своей?

проще заказать в хороший CRISPER сервис

https://www.google.com/search?hl=en&ei=WuZO...Q4dUDCAs&uact=5

да чего мне закзазывать? я сам себе хороший сервис ... Сделать как в инструкции воообще не проблема ... Там думать не надо. Все проще уж некуда.

Мне вот интересно поиграть с этим... свою систему сделать которая учитывает некоторые весьма специфические требования , навряд ли оно кому еще понадобится впрочем. Мно мне вот инттересно ...

и Вопрос реально прикольный ... не могу найти ответ и все тут. Вот если бы я спрашивал про самый конец этой РНК.. тут все сделано и известно в лучшем виде, и шпилкьку эти мутировали и показали что она критична , а вот этот участок между шпилькой и 20 концевых нуклеотидов совершенно темный лес. На каких-то картинках видел там еще 4 нуклеотида было... но сомнение берет , может художник просто так нарисовал, для красивости.

вот вроде Натуре Методс продакшион ... но там нет шпильки этой ... странно даже ... вроде консультанты там вполне приличные , а это не заметили...https://youtu.be/4YKFw2KZA5o

Ну вот тут отличное видео ... сразу все стало крисстально ясно. Ну и ладно , сделаю свой прибамбас с другого конца там где промотор и транскрипция начинается ... Там все известно что куда и как.

A supplemental video from the 2017 review by Fuguo Jiang and Jennifer A. Doudna, "CRISPR–Cas9 Structures and Mechanisms," from the Annual Review of Biophysics: annualreviews.org/doi/10.1146/annurev-biophys-062215-010822?utm_source=vimeo&utm_medium=bb.doudna&utm_campaign=suppvideo

Thank you for this information. slotxo

Астер, а пошто мучиться с КРИСПом? Там же лидирующая РНК иногда ошибается и нуклеазы режут не то и не там. А это никуда не годится. Наши квантовые реплики ДНК и РНК узнаЮт все точно и на автомате.

"да чего мне закзазывать? я сам себе хороший сервис ... Сделать как в инструкции воообще не проблема ... "©

нюню

через год расскажешь чем все закрнчилось

Расскажу-расскажу.

У нас кстати задачи очень специфические , мы с декоративными растениями работаем... и то что сельскохозяйственникам в Криспер-Каспе не нравится .. ( я так понял о чем вы намекаете) .. то нам именно это самое и интересное ... Соматическая химеризация которая не передается по наследству. Это золотое дно.

понял пестики тычинки

извини Геном Человека

астер ИКС не епи людям моски закажи камунить из проффи

https://yandex.ru/video/search?text=%D0%B0+...%81%D0%B0%D0%BC

ваамщето на МКБ задолбали медики и флористы

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ

https://62e8ce2ae5d50.site123.me/
https://www.vingle.net/posts/4647029
https://eatsleepride.com/c/383272
https://anotepad.com/notes/prkpsawt
https://demo.wowonder.com/1665548793521727_195426
https://linktr.ee/omegawatches89
https://omegawatches89.gumroad.com/p/reason...replica-watches
https://omegawatches93.mystrikingly.com/
https://writer.zoho.com/writer/open/k3enw04...fea14e95e0ee806
https://www.edocr.com/v/rakkz4oq/omegawatch...-replica-online
https://diigo.com/0pigfx
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/reaso...replica-watches
https://www.worldranklist.com/preview/bookm...s-Online-Store-
https://omegawatches89-95.webselfsite.net/contact
https://form.jotform.com/223252982096057