Полная версия страницы  English  

Формалинизация эритроцитов

robox22, 31.03.2020 22:52
Всем привет. Не получается формалинизировать человеческие эритроциты. Делал по след. рецепту: свежую кровь смешивал с охлажденным раствором цитрата натрия 2.5% в пропорциях 3:1, далее отмывал эритроциты 3 раза раствором хлорида натрия 0.9% при 3000 об. После к 50% суспензии эритроцитов доливал охлаждённый формалин(40% без метанола ph7) в пропорции 1:1. После этого эритроциты становились темнокоричневыми и теряли способность сорбировать вирусные антигены, собственно для этого они мне нужны. Раньше использовал только свежие эритроциты, но они хранятся максимум неделю. Подскажите пожалуйста как правильно приготовить формализированые эритроциты?
vb, 31.03.2020 23:57
с человечьими не работал, а бараньи формалинизировали 4% формальдегидом. плюс там еще глюкозу добавляли. а чтобы эритроциты лучше сорбировали иммуноглобулины использовали танин. еще лучше пришивать иммуноглобулины амидолом. но там от дальнейшей судьбы зависит - с амидолом не всегда хорошо хранится.
еще вместо формальдегида иногда акролеин хорошо себя показывает, но тоже есть ограничения.
vb, 01.04.2020 00:00
ищите старую литературу по фамилиям Каральник, Коникова,Баяр, Барбан
скорее всего придется в бумажную библиотеку ножками потопать. уж больно у вас методы старинные.
Bear, 01.04.2020 10:19
подписался на тему. Буду рад, если кто-нибудь отсканирует эти древние методы для общественности.
Bear, 01.04.2020 10:27
Вот есть публикация.

Каральник, Борис Вольфович.
Эритроцитарные диагностикумы [Текст]. - Москва : Медицина, 1976. - 162 с. : ил.; 22 см.
FB Б 76-4/1260
FB Б 76-4/1261
FB Арх
Bear, 01.04.2020 10:32
Поверхностные белковые антигены R. PROWAZEKII, R. TYPHI, R. SIBIRICA, C. BURNETII - как основа для создания новых диагностических и профилактических препаратов : автореферат дис. ... доктора медицинских наук : 03.00.07 / Челябинская гос. мед. академия. - Челябинск, 1998. - 39 с.
Микробиология
Хранение: FB 9 98-6/3381-6;
Хранение: FB 9 98-6/3382-4;
Bear, 01.04.2020 10:33
Вот тут можно патент почитать Каральника

https://rusneb.ru/catalog/000224_000128_000...19781130_A1_SU/
vb, 01.04.2020 11:05
Да, я просмотрел,тчто у автора антигены нужно пришивать. С антигенами сложнее. Все методы, в основном с антителами разработаны. Но, нет ничего невозможного. У меня дипломная была по влиянию методы фиксации и сенсибилизации на дальнейшую сушку. Лиофилизированный препараты хранились десятилетиями, если все правильно сделать.Не думал, что метод ещё пользуется популярностью. Вечерком поищу, где-то у меня список литературы с моей дипломной хранится. Давно это было, ещё в лексиконе набрано smile.gif. А с Каральником я внезапно встретился на конференции в 2014м smile.gif.
Bear, 01.04.2020 11:32
лексикон! Это стронг и реальный old school!
CowDoc, 01.04.2020 13:03
(vb @ 01.04.2020 11:05)
Ссылка на исходное сообщение  Лиофилизированный препараты хранились десятилетиями, если все правильно сделать.

Формалинизированные никаких проблем нет лиофилизировать (для наших определенных диагностических целей). А вот нативные, и чтобы они целенькими остались (тк с рядом вирусов, сразу садится активность, как формалинизируешь).
Когда-то тж занимался. Дипломница даже у меня была по этой теме. Посмотрю, что найду. Но уже написали принцыпы. Топикстартер, концентрированный брал ф., + рН/отмывка, вот и проблемы.
CowDoc, 01.04.2020 13:10
Может пригодится (файлы приаттачить не могу, что-то с сайтом):

Методика, предполагающая фиксацию и сенситизацию
(Без этих этапов процесс лиофилизации будет более простым)

Фиксация эритроцитов человека
*либо формалином (при комнатной температуре смешать равные объемы 10% клеточной суспензии и 10%–го раствора формалина в PBS. Инкубация 8 часов при 37°С . Далее клетки промывают трижды в дист. воде и 1 раз в физ. растворе. Конечную 20%-ную суспензию клеток в физ. растворе стабилизируют 0,1% азидом и хранят в холодильнике в течении нескольких месяцев;
*либо глютаральдегидом (заранее готовим буфер, смешиванием 1-го объема PBS, [0,15М, pH 8,] с 9-ю объемами физ. раствора и 5-ю объемами дист. воды. Этот буфер охлаждаем до +4°С и в нем готовим 1% раствор глютаральдегида. В 1%-ном растворе глютаральдегида создают 1% суспензию клеток, которую инкубируют 30 минут при +4 С. Затем клетки отмывают 5 раз дистиллированной водой, 5 раз – физ. раствором. 20%-ную суспензию клеток в физ.растворе стабилизируют 0,1% азидом и хранят в холодильнике [ ]

Тонирование и сенситизация эритроцитов человека
используют либо tannic acid, либо chromium chloride.
Вариант сенситизации 1. Смешивают равные объемы 2% суспензии фиксированных клеток и раствор tannic acid (1/15 000), выдерживают 40 минут при 37°С. Далее клетки промывают дважды и конечный осадок взвешивают до 2%-ной суспензии в растворе антигена. Раствор антигена готовят на смеси PBS и физ. раствора. Клетки выдерживают 50 минут при 37°С.
Далее клетки промывают дважды и используют сразу, либо дополнительно стабилизируют формалином (конц. не указана) для более позднего использования.
Вариант сенситизации 2. Эритроциты взвешивают в виде 2% суспензии в растворе антигена. Наиболее оптимальную концентрацию раствора антигена находят в предварительных экспериментах. Время инкубации – до часа при 37°С.
Далее на каждый миллилитр суспензии клеток приливают 0,4 миллилитра 0,8%-ного раствора chromium choride Cr Cl3*6H2O на дистиллированной воде. Раствор chromium choride готовят непосредственно перед использованием из 10%-ного стока. Клетки выдерживают с агентом 7-10 минут, после чего промывают дважды физ. раствором.
Фиксированные клетки, сенситизированные по обоим вариантам, хранятся при 4°С несколько недель. Для более длительного хранения их лиофилизируют [ii].

Буфера для лиофилизации
К 2%-ной суспензии клеток (фиксированных) в растворе антигена сразу после времени, достаточного для сенситизации, приливали равный объем 6%-ного раствора формалина. рН=7,2. Формалин вливаем плавно, медленно перемешивая.
Клетки выдерживаем с формалином при 37°С , 3-4 часа. Это делается для дополнительной стабилизации комплекса эритроцит-сенситизатор. Затем клетки отмывают дважды в смеси (½ физ-раствора+1/2 PBS). Конечный осадок ресуспендировали до 6%-ной концентрации в PBS, содержащем 6% сыворотки [ii].

Полученную смесь разливают в ампулы/пенициллинки по 1-3 мл, охлаждаю на сухом льде, погружением в жидкий азот на 30 секунд или в морозильной камере до -70˚С, -80˚С. Если это не возможно, охлаждают в камере лиофилизатора до -40 ˚С со скоростью -1С/мин.

Лиофилизация эритроцитов барана
Забор крови барана
Цельную кровь забирали в бутыль, содержащий раствор Альсевера (20,5 г глюкозы, 0.2 г NaCl, 8 г цитрата натрия, 0.55 г лимонной кислоты на 1 литр дистиллированной воды). Наполнение бутыля с раствором Альсевера проводят до тех пор, пока соотношение объемов кровь : раствор не станет 1:1. Фиксацию эритроцитов проводят обязательно в тот же день [ ].

Эритроциты следует промыть в охлажденном физ. р-ре не менее 5 раз, при скорости вращения центрифуги не более 1000 g. Время осаждения – 15 минут/цикл. Конечный осадок ресуспендировать в PBS до 10-12% концентрации.

Фиксация эритроцитов барана (без сенсибилизации)
К нативной крови барана, разведенной вдвое раствором Альсевера, либо к 10% суспензии промытых эритроцитов в PBS добавляют:
а) равный объем 0,3-0,5% раствора глютеральдегида
или
б) равный объем 4% раствора формалина в цитрате натрия (0.15 M).
Раствор альдегида приливают медленно, плавно перемешивая. Смесь оставляют на ночь при 37°С на шейкере в медленном режиме. Затем клетки промывали 5 раз в PBS при 1000 g в течение 20 минут. [i]

Фиксация эритроцитов человека (без сенсибилизации)
*либо формалином (при комнатной температуре смешать равные объемы 10% клеточной суспензии и 10%–го раствора формалина в PBS. Инкубация 8 часов при 37°С . Далее клетки промывают трижды в дист. воде и 1 раз в физ. растворе. Конечную 20%-ную суспензию клеток в физ. растворе стабилизируют 0,1% азидом и хранят в холодильнике в течении нескольких месяцев;
*либо глютаральдегидом (заранее готовим буфер, смешиванием 1-го объема PBS, [0,15М, pH 8,] с 9-ю объемами физ. раствора и 5-ю объемами дист. воды. Этот буфер охлаждаем до +4°С и в нем готовим 1% раствор глютаральдегида. В 1%-ном растворе глютаральдегида создают 1% суспензию клеток, которую инкубируют 30 минут при +4 С. Затем клетки отмывают 5 раз дистиллированной водой, 5 раз – физ. раствором. 20%-ную суспензию клеток в физ.растворе стабилизируют 0,1% азидом и хранят в холодильнике [ ]

ё) Наиболее эффективным методом считают двойную фиксацию эритроцитов глютаральдегидом и сульфосалициловой кислотой:
стоковый раствор 25% глютаральдегида обрабатывают активированным углем, разводят до 1% смесью двух объемов PBS и одного объема воды. Эту смесь охлаждают на водяной бане и ею разбавляют отмытые эритроциты барана до формирования 2% суспензии. Экспозиция длится 30 минут при 4°С и периодическом перемешивании. Затем клетки промывают трижды PBS, ресуспендируют в PBS до 10%, вносят поливинилпирролидон до 1% и приливают равный объем 1,5% сульфосалициловой кислоты в PBS, в котором также содержится 1% поливинилпирролидона. Клетки выдерживали 30 минут при комнатной температуре, плавно перемешивая. Затем их отмывают трижды и подвергают сенситизации [ ].
CowDoc, 01.04.2020 13:11
Сбросите в личку мейл, пришлю подборку, делал 100 лет назад
vb, 01.04.2020 17:02
Как много у нас тут специалистов по эритроцитарным диагностикумам. А то все ПЦР да пцр
vb, 01.04.2020 23:47
1.Адамов А.К.Свойства антител, фиксированных на частицах,и
перспектива их применения в микробиологии//Ж. микробиоло-
гии.-1965.-N 2.-С.100.
2.Азаренок К.С. К возможности обнаружения токсина в крови
больного ботулизмом при помощи реакции пассивной гемагг-
лютинации// Ж. микробиол.-1970.-N 7.-С. 112.
3.Ахметов Н.С. Общая и неорганическая химия.-М.:В.Ш.,
1981.-С. 358-359.
4.Барбан П.С. Fab-фрагменты антител как основа антимикробных
иммуноглобулиновых препаратов//Автореф. док.
дисс.-М.-1980.
5.Барбан П.С. О механизме сенсибилизации эритроцитов белками
в связи с пространственными взаимоотношениями иммуногло-
булинов и их фрагментов с поверхностью танизированных
эритроцитов//Ж. микробиологии.-1980.-N 6.-С.103.
6.Баяр Г.А., Коникова Р.Е., Крылов В.Н. методике постановки
реакции непрямой гемаггютинации с эритроцитами, сенсиби-
лизированными антителами//Ж. микробиологии.-1966.-N 7.-С.
97.
7.Березкина Г.В., Никитюк Н.М., Филимонова И.Н., Опочинский
Э.Ф. Диагностическая эффективность листериозного эритро-
цитарного антигенного диагностикума.//ЖМЭИ.-1993.-N 6.-С.
93-94.
8.Вайсман И.Ш. и др.Исследование реакции непрямой гемагглю-
тинации на уровне ультраструктур//Ж. микробиоло-
гии.-1978.-N 7.-С.136.
9.Гайдамович С.Я., Клиссенко Г.А., Шаноян Н.К. Реакция агг-
лютинации сенсибилизированных антителами эритроцитов ви-
русом колорадской клещевой лихорадки// Вопр. ви-

- 45 -
русол.-1974.-N 2.-С. 169.
10.Горисюк А.Ф., Голодюк Л.Ф. Формирование противодифтерий-
ного иммунитета при иммунизации кроликов соматическими
антигенами дифтерийной палочки// В кн.: Вакцины и сыво-
ротки.-Киев, 1973.- вып. 7.-С. 57.
11.Дорошкевич Л.Ц. О модификации метода сенсибилизации эрит-
роцитов антителами с помощью солей хрома//В кн.: Вопросы
серологической диагностики.-Алма-Ата,1975.-С. 45.
12.Дьяченко Н.С.//Пассивная гемагглютинация и ее применение
в вирусологии.-Киев:Наукова думка,1979.
13.Иммунологическая диагностика вирусных инфекций/Под ред.
Т.В.Перадзе,П.Халонена.-М.:Медицина,1985.-С. 98-120.
14.Каральник Б.В. Научные основы изготовления эритроцитарных
диагностикумов//Ж. микробиологии.-1977.-N 4.-С.29.
15.Каральник Б.В.,Трошина Г.И. О характере сил взаимо-
действия эритроцитов и бактериальных сенситинов. Сообще-
ние 1//ЖГМЭИ.-1969.-N 2.-С.150.
16.Каральник Б.В. Количественный анализ процесса взаимо-
действия эритроцитов и бактериальных антигенов. Сообщение
8//Ж. микробиологии.-1972.-N 9.-С. 77.
17.Каральник Б.В., Царевский Ю.П., Шамардин В.А.//Эритроци-
тарные белковые диагностикумы.-Алма-Ата: Наука, 1981.
18.Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы.-М., 1976.
19.Клиссенко Г.Б.,Лаврова Н.А.,Аннун К. и др. Реакция непря-
мой гемагглютинации для индикации вируса Западного Нила в
крови животных и комарах при экспериментальной инфекции//
В кн.:Экология вирусов.-М.,1980.-С. 71-76.
21.Кондрашова З.Н. и др. Реакция непрямой гемагглютинации
как группоспецифический тест диагностики некоторых ви-
русных заболеваний//В кн.: Вопросы медицинской вирусоло-

- 46 -
гии.-М., 1975.-С. 156.
22.Коникова Р.Е., Баяр Г.А. К усовершенствованию методики
консервирования эритроцитов для реакции непрямой гемагг-
лютинации//Лабораторное дело.-1967.-N 4.-С. 242.
23.Коникова Р.Е.,Баяр Г.А. Методика консервирования сенсиби-
лизированных эритроцитов для реакции непрямой гемагглюти-
нации//Лабораторное дело.-1965.-N 2.-С.73-74.
24.Коникова Р.Е.,Носков Ф.С.,Баяр Г.А. Применение РНГА для
выявления вирусов группы клещевого энцефалита//Вопр. ви-
русол.-1968.-N 2.-С.159-163.
25.Коникова Р.Е.,Носков Ф.С.,Баяр Г.А. Разработка эритроци-
тарных препаратов для выявления антигенов и антител в
РНГА//В кн.:Реакция непрямой гемагглютина-
ции.-Л.,1981.-С.13-31.
26.Корнеева Э.П.,Прозорова И.Н.,Шварцман Я.С.,Ильенко
В.И.Использование РНГА для определения антител к вирусу
японского энцефалита//Лабораторное дело.-1975.-N
12.-С.729.
27.Крам Д., Хэммонд Дж. Органическая химия.-М.: Мир,
1967.-С. 319-320.
28.Лакин Г.Ф. Биометрия.-М.:В.Ш.,1980.
29.Леви М.И., Орлова Г.М., Сучков Ю.Г. Серологические иссле-
дования при чуме//Труды Азербайдж. противочумной стан-
ции.-1962.-т. 3.- С. 281.
31.Лещук С.И. Совершенствование иммунодиагностикума для оп-
ределения HBs Ag методом реакции обратной пассивной ге-
магглютинации и его клинико-эпидемиологическое испытание
в Восточной Сибири. Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. Ир-
кутск, 1991.
32.Макаров К.А., Кибардин С.А. Иммобилизированные биопрепа-
раты в медицине.-М, 1980.

- 47 -
33.Меньшов П.И., Шмутер М.Ф. Подбор оптимальных методов фор-
малинизации эритроцитов для приготовления стойких эритро-
цитарных диагностикумов для чумы и бруцеллеза// Пробл.
особо опасн. инф.- 1969.-вып. 6.-С. 231.
34.Образцова Е.М. Антигенные эритроцитарные препараты для
обнаружения антител к Yersinia enterocolitica сероваров
О:5,О:7,8;О:6,30//Ж. микробиологии эпидемиологии и имму-
нобиологии.-1993.-N 6.-С. 91-92.
35.Оловников А.М. Определение содержания антигенов по агглю-
тинации эритроцитов, покрытых поликонденсированными тет-
раазотатом диаминодифениламина белками антисыворотки//
ДАН СССР.-1966.-т. 169.-С. 1180.
37.Полевая О.Ю.,Ковалев И.Е. Принципы синтеза конъюгирован-
ных антигенов//Химико-фармацевтический жур-
нал.-1978.-т.12.-N 2.-С.8.
38.Полинг Л., Полинг П. Химия : пер. с англ.-М.:"Мир",
1978.-С. 482-483.
39.Радавский Ю.Л., Зайцева Л.С., Кухарь В.П. Бифункциональ-
ные поперечносшивающие реагенты и методы получения конъ-
югатов пептид-носитель// Биополимеры и клетка.-1993.-т.
9.-N 4.-С. 3-21.
40.Сафронов Б.Н. и др.//Лаб. дело.- 1964.-N 9.-С. 52.
42.Справочник по микробиологическим и вирусологическим мето-
дам исследования/ Под ред. М.О. Биргера.-М:"Медици-
на",1982.
43.Справочник химика.-М.:ГНТИХЛ, 1963.-т. 2.-С. 417-417.
44.Субботина Ю.Л., Левинсон В.И. Количественное определение

- 48 -
иммуноглобулинов в реакции торможения гемагглютинации.
Сообщение 2. Сравнение с результатами радиальной иммуно-
диффузии//ЖМЭИ.-1980.-N 6.-С. 76-81.
45.Сучков Ю.Г.,Канатов Ю.В. Сенсибилизация формалинизирован-
ных эритроцитов иммунными гаммаглобулинами//Ж.микробиоло-
гии.-1965.- N 8.-С.63.
47.Царевский Ю.П., Каральник Б.В. Молекулярные аспекты взаи-
модействия альбумина и танизированных эритроцитов.Сообще-
ние 1//Ж. микробиологии.-1975.-N 4.-С.98.
48.Химический энциклопедический словарь.-М.: "Сов. энцикло-
педия",1983.-С. 133, 689.
49.Химия и функция белков/Гауровиц Ф.-М.:1965.
50.Черняев Ю.А., Бондаренко Т.В. Сенсибилизация эритроцитов
для РПГА с помощью хлористого хрома и методы их консерви-
рования.//В кн.: Вопросы ветеринарной вирусологии.-Влади-
мир, 1976.-С. 142-143.
52.Эссель А.Е. Реакция непрямой гемагглютинации.-М., 1964.
53.Boyden S.V. The adsorption of proteins on erythrocytes
treated with tannic acid and subsequens hemagglutination
by antiprotein sera// J. exp. Med.-1951.-v. 93.-p. 107.
54.Edelberg R.G.// Cell. Compar. Phisiol.- 1953.-N 41.- P.
37.
55.Godal T. On the adsorption of thyroglobulin to
formalinizid and tannid human erythrocytes// Acta pathol.
microbiol. Scand.-1966.-v. 68.-p. 249.
56.Grmlich F., Mohring D., Muller H.E. Quantitative

- 49 -
Untersuchungen zur Beladbarkeit normaler und
vorbehaandelter Kaninchenerythrocyten mit
Humanalbumin-I(131) und gammaglobulin-I(131)//Ztscr. Hyg.
Infektionskrankh.-1963.-Bd. 149.-s. 187.
57.Kozin F., McCarty D.J. Molecular orientation of
immunoglobulin G adsorbed to microcristalline monosodium
urate monohydrate//J. lab. clin. Med.-1980.-v. 95.-p. 49.
58.Kumagai R.N., Balducci D. Analisi dei fattori infuenzanti
la sensibilita della emoagglutinazione e della inibizione
della emoagglutinazione di emazie trattate co acido
tannico e coningate con protein// Rend. ist. super.
sanit.-1959.-v. 224. -p. 368.
59.Martiner O.V. e.a. Purfication of the extracellular
opacity factor of a strain of group A Streptococcus N
type 2// J. Gen. Microbiol.-1978.-v. 105.-p. 29.
60.Reddy D.R., Hariprasada R., Padma M.C., Lopal V.R.
Haemagglutination test to detect Tobacco Mosaic Virus
antigens // Indian J. exp. Biol.-1969.-v. 7.-p. 162.
robox22, 02.04.2020 20:41
Большое спасибо всем кто откликнулся!
vb, 02.04.2020 22:44
(robox22 @ 02.04.2020 18:41)
Ссылка на исходное сообщение  Большое спасибо всем кто откликнулся!

ты заходи, если что.
если бюджет позволяет - лучше нанять человека, делавшего это руками wink.gif , чтобы самому на все грабли не наступать
Bear, 03.04.2020 10:47
мы использовали такой вариант:
1. использовали свежую консервированную кровь барана;
2. Кровь разбавляли раствором Олсвера;
3. К 25 % взвеси отмытых эритроцитов (400 мл), при интенсивном перемешивании, постепенно добавляли 160 мл 50% нейтрального формалина.
4. Полученную смесь два часа грели на водяной бане 37 градусов,
5. центрифугировали 3000-4000 оборотов.
6. Отмытые физраствором эритроциты выдерживали двое суток при 4 градусах.
Daemonarchestratygos, 15.04.2020 01:43
Молбиол жив! jump.gif beer.gif
Li-Cor, 15.04.2020 21:55
(Bear @ 03.04.2020 11:47)
Ссылка на исходное сообщение  мы использовали такой вариант:
1. использовали свежую консервированную кровь барана;
2. Кровь разбавляли раствором Олсвера;
3. К 25 % взвеси отмытых эритроцитов (400 мл), при интенсивном перемешивании, постепенно добавляли 160 мл 50% нейтрального формалина.
4. Полученную смесь два часа грели на водяной бане 37 градусов,
5. центрифугировали 3000-4000 оборотов.
6. Отмытые физраствором эритроциты выдерживали двое суток при 4 градусах.



"использовали свежую консервированную кровь барана" ©

видмед smile.gif
Bear, 15.04.2020 22:17
(Li-Cor @ 15.04.2020 22:55)
Ссылка на исходное сообщение  "использовали свежую консервированную кровь барана" ©

видмед  smile.gif


yes.gif тут нет противоречия
Li-Cor, 15.04.2020 22:22
(Bear @ 15.04.2020 23:17)
Ссылка на исходное сообщение  yes.gif тут нет противоречия


понял smile.gif
Li-Cor, 15.04.2020 22:27
(vb @ 01.04.2020 18:02)
Ссылка на исходное сообщение  Как много у нас тут специалистов по эритроцитарным диагностикумам. А то все ПЦР да пцр

я формалинил эритроцыты питуха как Геном Стандарт для проточки
Bear, 15.04.2020 22:39
Тут важно кровь свежую (сразу из барана) консервировать
Li-Cor, 15.04.2020 22:44
(Bear @ 15.04.2020 23:39)
Ссылка на исходное сообщение  Тут важно кровь свежую (сразу из барана) консервировать

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6839881/?fr...etry&from_pos=1
Bear, 16.04.2020 08:32
Li-Cor, круто, например!
Li-Cor, 16.04.2020 19:56
(Bear @ 16.04.2020 09:32)
Ссылка на исходное сообщение  Li-Cor, круто, например!

видмеды едят форел а не баранов

https://yandex.ru/search/?text=%D0%BC%D0%B5...&clid=1961774-1
Li-Cor, 16.04.2020 20:22
(Bear @ 16.04.2020 09:32)
Ссылка на исходное сообщение  Li-Cor, круто, например!

зря царя свергнули в эпоху COVIR-19
https://tour-vestnik.ru/tsarstvennyye-sestr...doma-romanovykh
IAM1688, 28.10.2021 11:32
Write your topic Live22 There’s a lot of noise to compete against when ไฮโล writing on the internet. ราคา บอล Anyone can write something, post it, and call it an article รูเล็ต in the information age, sa gaming 1688 the definition of an article has become a very blurred line. Alice run The line between good and bad, สล็อต22 however, is much more defined
and arguably, more important. โปรแกรมโกงบาคาร่า Good content is relatively easy to create. เกมวัววัว Most people don’t realize it, but everybody has interesting things to say. ลิ้งรับทรัพย์ the main point of your สมัคร สล็อต ka gaming article. It gives the reader a clear picture สูตรโกงบาคาร่า Good technique is harder ka gaming it can seem abstract and nuanced how the main points connect with the 1688คาสิโน How many times have you seen rows and rows of dense paragraphs and lost interest
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.