Коллеги, столкнулся с очень странной штукой.
Экспрессирую фьюжен Fab фрагмент с прицепом (прицеп: soluble decoy receptor для одного цитокина). Прицеплено по классике, через поли-глициновый линкер GGGGSGGGGSGGGG. Стабильная линия Т293 клеток (двумя лентивирусами зараженная и на двух антибиотиках селектированная). Среда PRO293a-CDM (animal protein free) от Лонзы.
Собираю супернатант, аликвоту на вестерн (c goat anti-Human IgG - HRP). Все красиво. Тяжелая цепь с прицепом рассчетного мол веса (около 65-70 кило); легкая цепь тоже как надо - около 25 кило.
В 50мл супера добавляю 50 мкл Protein L agarose (200 ul of 25% slurry), таблетку протеазных ингибиторов (заранее растворенную в кубике PBS, концентрация правда в 5 раз меньше рабочей если добавлять в клеточный лизат). Бултыхаю ночь, собираю агарозу, элюирую как обычно, кислым глицином pH-2.8, нейтрализую быстренько недоведенным трисом. Форежу (reducing/non-reducing). Крашу кумасёй.
Смотрю и не могу понять на что.
Reducing: один бэнд порядка 25 кило
Non-reducing: 2 бэнда - около 40 кило и около 20 кило
Почему думаю, что отваливается прицеп - крашу элюированной чачей клетки на ФАКСе - все прекрасно красится (вторичные антитела - anti-Human-FITC, Fab specific). Получается что Fab остается интактным, и от него именно на агарозе отваливается прицеп.
Вот что это такое?
Картинки могу приложить по требованию.
Заранее спасибо!
 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
Деградация фьюжен антитела на колонке
petr, 30.04.2020 03:20
watchesbiz, 27.10.2021 06:02
watchesonline89, 25.12.2022 10:28
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.