Полная версия страницы  English  

Конкретный вопрос

Anonymous, 19.09.2001 18:43
Привет всем участникам, так сказать...
У меня довольно конкретный вопрос по поводу мол.биологии - я сам пока во всех этих науках не очень - поэтому прошу совета:
Задача:
у меня есть некая бактерия (Rhodobacter capsulatus), в бактерии есть некий фермент (Complex I - то есть первый путкт их дыхательной цепи) - всего 14 субъединиц и все находятся в одном опероне.
Цель:
сделать вектор этого оперона и вставить его в бактерию - (в E.coli не получится - пробовали) - то есть обратно в Rhodobacter capsulatus. В результате концентрация фермента возрастет (4-6 раз достаточно) и можно будет его мучить ЭПРом. Естественной концентрации недостаточно, даже для новомодных суперЭПРных машин.
Длина оперона - 19K. Сделали ПЦР половинок, потом рестрикции серединных концов по SacI - в настоящий момент есть ети две половинки по 9.5К, их предполагается лигировать и получить целый фрагмент. Потом его надо засунуть в некую плазмиду и потом в клетку. К сожалению у етого родобактера толстая стенка наружняя и электропорацией это сделать довольно сложно (как специалисты говорят). Поэтому придется, видимо, использовать др. метод с клетками хелперами.
Вопросы:
1. По какому принципу выбирать и где взять подходящую плазмиду ? Насколько я понимаю необходимо чтобы могла жить в Родобактере (а), делала мало копий себя (б) и подходила по сайтам рестрикции (NdeI c начала и XbaI с конца) (в), вероятно, надо еще и чтоб был промотор, так как в непонятно, есть собственный промотор в опероне или нет. Какие еще могут быть требования ?
2. Связываться с клетками хелперами и второй плазмидой как-то не оч. хочется - потому возможно ли засунуть плазмиду все таки путем электропорации ??
Хорошо бы конкретный совет или ссылку киньте на ресурс...
заранее благодарен
shure
Anonymous, 20.09.2001 21:00
Наводящие вопросы:
Непонятно - вам нужен штамм Rhodobacter-суперпродуцент фермента или собственно фермент в склянке? Что значит "в колях не получится - пробовали"? Экспрессия? Тогда какой вектор? Может быть, попробовать экспрессировать по частям и ассоциировать их in vitro?
Anonymous, 21.09.2001 21:11
Привет...
Спаспибо за ответ
по порядку
<BLOCKQUOTE><font size="1" face="Verdana, Arial">quote:<HR>вам нужен штамм Rhodobacter-суперпродуцент фермента или собственно фермент в склянке<HR></BLOCKQUOTE>
Нам нужен препарат фермента, чтоб в перспективе его изучать ЭПР-спектроскопией. В данной бактерии (по сравнению с другими и митохондриями) концентрация фермента в мембране мала, для того, чтоб разрешить потом спектр. Повысив концентрацию фермента даже в 3-5 раз, на современных машинах это можно сделать. Возражение насчет выделения и исследования в "чистом" виде: во-первых выделить подобный фермент пытались и не один раз, но в процессе выделения теряются некоторые свойства (чувствит. к специф. ингибиторам, в определенной степени могут диссоциировать редокс-компоненты (которых там оч. много)). Да и в принципе, так как фермент функционален только в составе мембраны - то это накладывает ограничения на выделение - либо целые клетки, либо т.н. суббактериальные частицы. Идея о очистке ферментаи встраивании его в фосфолипидные везикулы не нова и долго и тщательно проверялась, пока не оч. успешно.
<BLOCKQUOTE><font size="1" face="Verdana, Arial">quote:<HR>Что значит "в колях не получится - пробовали"? Экспрессия? Тогда какой вектор?<HR></BLOCKQUOTE>
Скажу честно, этого не знаю. Пробовал не я и только отдельные субъединицы - говорят образуются inclusion bodies...
<BLOCKQUOTE><font size="1" face="Verdana, Arial">quote:<HR>Может быть, попробовать экспрессировать по частям и ассоциировать их in vitro??<HR></BLOCKQUOTE>
Не уверен, но это мало пользы принесет IMHO... Довольно сложный комплекс, железосерные кластеры, флавин...
Спасибо...
с уважением shure
Anonymous, 25.09.2001 22:20
Для облегчения электропорации можно попробовать подобрать режим подращивания в богатой среде, чтоб клеточная стенка не успевала утолщаться. У колей есть разные методы, надо взглянуть в старые книги, когда эффективность была небольшой и изголялись по черному. В общем снимать на порацию где-то на 13-12 ОД от плато роста. Среду побогаче, клеток поменьше и вперед.
Anonymous, 26.09.2001 15:10
спасиббо...
это более менее понятно, да...
totosite, 18.12.2020 07:39
How can you think of this?토토커뮤니티사이트I thought about this, but I couldn't solve it as well as you.토토커뮤니티I am so amazing and cool you are. I think you will help me. I hope you can help me.토토사이트
totosite, 18.12.2020 07:40
I want to talk to you about your writing. If you think so too, come to me.토토사이트
totosite, 18.12.2020 07:41
I was thinking a lot before reading this article.토토커뮤니티But reading this article solved all the problems.토토커뮤니티사이트So I expressed my gratitude to my blog. My blog is "토토사이트"
totosite, 18.12.2020 07:42
Your writing is perfect!! You gave me great joy!! Please come to my site and give your opinion. 토토사이트
totosite, 18.12.2020 07:43
Read my article and let us know your opinion.토토사이트I want to solve this problem. I think you can solve it enough.토토사이트
kimkibang, 30.01.2021 13:28
this is one very interesting post. I like the way you write and I will bookmark your blog to my favorites.토토커뮤니티
kimkibang, 30.01.2021 13:32
Nice information, valuable and excellent design, as share good stuff with good ideas and concepts.메이저사이트
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.