Коллеги,
Постановка задачи :
Я пытаюсь пришить моноклнальное IgG к гидразид-агарозе, при этом использую периодатное окисление сахара (антитело гликозилированно). У меня проблемы с воспроизводимостью опыта.
Вопросы:
1)Знает ли кто-нибудь хорошо работающую методику ( упор на концентрации периодат/антитело при предокислении).
2)Какие характерные ошибки могут иметь место.
3)Как,(может быть специально) готовить антитело для окисления из асцита, кроме хроматографии на белке G и последующего диализа в необходимый буфер, в моем случае NaAc/AcH pH 5.0).
Спасибо.

Возможно нестабильность результата связана,
с непостоянством углеводного состава антител и присутствием в препарате антител посторонних полисахаридов и гликопротеинов. Предлагаю использовать радикально другой метод периодатной посадки антител с обработкой периодатом не Ab, а агарозы. Для этого необхолима не гидразин а просто агароза.

Антитело моноклонально, проводилась очистка на белке G, о каких посторонних гликопротеинах и тем более полисахаридах может идти речь.
Avor: Для этого необхолима не гидразин а просто агароза ????
Гидразид это группа -NH-NH2 на конце спейсера. Гидразидая группа взаимодействует с альдегидной получившейся в результате окисления вицинального цис-гликоля сахара в гликопртеине (а именно Ab).
Что будет с ПРОСТО агарозой при обработке периодатом и как вы собираетесь ковалентно пришивать антитело к ней.

Snail:
При окислении агарозы периодатом образуются диальдегиды (из 1,2 цис-диольных группировок), которые потом цепляются за амингруппы лизинов в белке. Последующее восстановление оснований Шиффа боргидридом дает стабильную сшивку.

Милый Snail! Зачем столько экспрессии? Guest дело говорит. Он меня понял. А насчет посторонних примесей у Вас, что белок G- колонка однаразавая? и получаете Вы ее стерильно чистой? и асцит у Вас стерильно получен и так же хранится? и буфера все стерильные? Любой пророст может давать посторонние примеси. Хотя, в идеале, вы должны получить чистый белок. А второе замечание вы даже не у слышали: Состав т.н. "вицинального цис-гликоля сахара" в антителах может изменятся от выделения к выделению и от хранения. Я предложил другой метод, как более надежный, в наших условиях, он менее зависим от всяких выкрутас с белком и его углеводной частью. Попробуйте не пожалеете. Подробности можно мылом.

Avor, извините за излишнюю экспрессию, но к сожалению присоединение за аминогруппы не устраивает, нужна нетронутая вариабельная часть. Скорее мы попробуем тогда сукцинимид активированную смолу. Меня очень заинтересовало изменение состава сахара от условий выделения и хранения, и вообще интересует где я поподробнее могу прочитать про эту модификацию.

Во первых: Сукцинимидные эфиры не более избирательны в отношении аминогрупп чем бромциан и периодат активированный полисахарид . А периодатный метод я предложил, потому что он дает очень устойчивую связь с матрицей, и у Вас есть все реактивы для этого метода (фактически белок и матрица меняются местами и все; просто агарозная матрица, по-моему, не проблема, да и дешевле) Да! При такой посадке часть антител теряет антигенсвязывающию активность, но это небольшая часть. Относительно полисахаридной части антител - это мое личное предположение, основанное на том, что полисахаридная часть антител не очень для них важна, в отличии, скажем от пероксидазы.

Еще вчера у меня возникли сомнения по поводу Вашего буфера для окисления. Глянул в протоколы и обратил внимание, что само окисление проводят в воде, а потом переводят в ацетатный буфер. Может и Вам так попробовать. Дело в том, что ацетат, видимо, может окисляться периодатом и мешать целевому окислению углевода. Привет

Avor,спасибо за советы.

С запозданием, но может быть полезно другим читающим: очень важно при пришивке на активированную периодатом агарозу не передержать время реакции. Начинается многоточечная пришивка и антитела денатурируют. Таким образом активность можно потерять ПОЛНОСТЬЮ, хотя пришъется весь белок. Это не пустая страшилка, некоторые на эти грабли уже наступали. Точное время не помню, но оно порядка нескольких минут.

Круто! А у нас народ по 48 ч. при 4С держал,и
что странно, колонка после этого работала.
Вот она философия биологии: антитела антителам рознь. Видимо, в каждом случае нужно подбирать условия. Всем успехов.

Извиняюсь за запоздалый вопрос (хотел раньше задать, да забывал) - а чьи эти моноклоны? Может, лучше что-то типа анти-анти попробовать, как в ELISA делают (антитела на константную часть Ваших антител)? И никакой химии (как бывший химик могу себе представить сколько побочных реакций идёт с белком при обработке чем-то суровым типа периодата, бромциана и др.)
С уважением

I used to suck at writing, big โกงบาคาร่า time! So I understand the ka gaming struggle. However, I had a 1688คาสิโน lot of help to improve my writing and blogging skills เกมวัววัว and I want to pay it forward to สมัคร สล็อต ka gaming help those sa gaming 1688 who had the same ลิ้งรับทรัพย์ struggles I did! The aim of an article is usually to ราคา บอล talk about a topic that we like or that we are familiar โปรแกรมโกงบาคาร่า with. Besides, one of the features that ไฮโล articles have as opposed to other FCE Writing tasks is รูเล็ต that an article must entertain the สล็อต22 reader and, almos always, สูตรโกงบาคาร่า recommend the thing we are Alice run talking about.

https://diigo.com/0pigcp
https://penzu.com/p/847cc342
https://writer.zoho.com/writer/open/k3enw4d...b0a3d8cf13c901a
https://eatsleepride.com/c/383274
https://anotepad.com/notes/byixar75
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...tches-930507835
https://form.jotform.com/223253469189061
https://padlet.com/omegawatches89/fvf9g8yhawsjurox
https://anotepad.com/notes/9393ncw8
https://www.crokes.com/omegawatches89/info/
https://www.merchantcircle.com/omegawatches89-houston-tx
https://trello.com/b/kEnu4Gm0/rolex-replica
https://www.instapaper.com/u
https://form.jotform.com/223253136113039
https://www.pinterest.com/pin/957859414473160488/
https://www.pinterest.com/pin/957859414473160566/
https://www.pearltrees.com/omegawatches89#item456651188
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040003/