Данная тема создана для размещения материалов и дискуссий по приложениям проточной цитометрии с визуализацией Amnis ImageStream.

Imaging_Flow_Cytometry_brochure.pdf Размер:: 12.08мб кол-во скачиваний: 313

Пример использования проточной цитометрии с визуализацией в нейробиологии:






После фагоцитоза, клетки промывали три раза холодным PBS и отсоединяли от планшетов с использованием трипсина (0,20%). Собранные клетки были фиксированы 2% PFA в течение 10 мин при комнатной температуре. Проточная цитометрия с анализом изображений клеток была выполнена на ImageStream X Mark II под управлением ПО INSPIRE (Amnis Corporation). Была зарегистрирована флуоресценция Aβ1-42 с 5-FAM с использованием возбуждения 488 нм лазером при 50 мВт, события собраны с помощью фильтра 480-560 нм в канале 2 (CH2), в то время как светлопольные изображения яркого поля были собраны в каналах 1 (CH1) и 9 (CH9). Образцы BV2, которые не были инкубированы с 5-FAM-мечеными Aβ1-42 (контрольный отрицательный фагоцитоз) собирали при тех же настройках в порядке гейтирования разных популяций клеток (отрицательный или положительный фагоцитоз). Анализ морфологии клеток был осуществлён на основе
В каждом эксперименте шаблон настроек, используемый для анализа
Контрольных клеток был создан и применен ко всем файлам.
Для каждого образца было собрано 10 000 событий; данные были проанализированы с использованием программного обеспечения IDEAS Application 6.1 (Корпорация Amnis).

Для дальнейшего подтверждения специфичности эндогенного ANXA1 эффекта на фагоцитозе Aβ1-42, мы протестировали эффект ANXA1 нокдауна на микроглиальный фагоцитоз 5-FAM-меченых Aβ1-42. BV2-клетки, инфицированные shRNA лентивирус ом(дикого типа, PKCO и shRNA ANXA1-клон 492) инкубировали (3 ч) с 5-FAM-меченным Aβ1-42 (5 мкг / мл) и измеряли фагоцитоз с использованием метода проточной цитометрии изображений клеток ImageStream. Эффективность
shRNA-инфекция показана на рисунках.
Как показано на рисунке, фагоцитоз 5-FAM меченых Aβ1-42 был значительно снижен в ANXA1 нокдаун по сравнению с контрольными клетками BV2 и
mock-инфицированных клеток BV2. Репрезентативные гистограммы цитометрического анализа изображений 5-FAM-меченых Aβ1-42
фагоцитоз показаны также на рисунках.
На рисунке показано количественное определение 5-FAM-меченого фагоцитоза Aβ1-42 клетками BV2.

А. Гистограмма показывает гейтирование клеток BV2.
B. Скаттер- плот показывает гейтирование сфокусированных клеток BV2
С. Гистограмма и изображения отрицательного и положительного 5-FAM-меченного фагоцитирования Aβ1-42 клетками BV2.
D. Репрезентативные гистограммы 5-FAM-меченого Aβ1-42фагоцитирования клетками BV2 (WT, контрольная shRNA и
shRNA ANXA1), инкубировали в течение 3 ч с 5-FAM-меченым Aβ1-42 (5 мкг / мл), добавляли к среде, кондиционированной BV2.

2016_Ries_JNeuroinflammation.pdf Размер:: 2.42мб кол-во скачиваний: 199