В этом протоколе используется свойство буфера PB4 адсорбировать на стекло только двухцепочечную ДНК. Буфер состоит из GuSCN и EDTA. Именно EDTA обеспечивает отмывку от одноцепочечных нуклеиновых кислот. Фактически, это адаптация метода из (Beld M, Sol C, Goudsmit J, Boom R. Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms. // Nucleic Acids Res. 1996 Jul 1;24(13):2618-9.) для silica центрифужных колонок.
На рисунке - пример использования метода. Дорожки (1) и (2) - исходная ДНК (двухцепочечная pGEM4Z и одноцепочечная pBluescript II SK(+)); (3) - смесь; (4) и (5) - элюированная ds и ss ДНК.
Изготовление silica spin колонок описывается в протоколе "Очистка pDNA на silica spin колонках". Там же описаны проблемы, которые может вызвать очистка на стеклянных мембранах (ингибирование некоторых ферментов).
Все промывки можно проводить не только на центрифуге, но и с помощью вакуумной промывалки.
По пунктам
п. 5.
Mg2+ из MgB нейтрализует действие EDTA и, кроме того, понижает pH раствора.
п. 6.
WB. Это - забуференный 80% этанол. Он используется для того, чтобы отмыть мембрану от хаотропных солей. Tris — необходимый компонент WB, так как чистый 80% этанол денатурирует двухцепочечную ДНК во время промвки.
п. 9.
EB. Низкосолевой буфер с pH в районе 7.0 - 8.5. В принципе, можно использовать просто воду, но нужно убедиться, что её pH находится в указанных пределах.