MolBiol.ru > Методы > PCR > Параметры реакции (температура, время) | |
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|
Параметры PCR реакции
Td=94oC, 10'',
а) те цифры, которые введены в PCR машину; Мы не пытаемся намекнуть на то, что прибор может быть неисправным (хотя и это возможно). Мы, опять таки, не имеем ввиду различие между двумя приборами одного типа - обычно на них можно не обращать внимание. Мы хотим сказать, что для различных типов приборов связь между (а) и (б) может быть принципиально различна. Рассмотрим реализацию прибором двух шагов температурного цикла: Tа=44oС, 30'', а) реальный цикл - гладкая кривая с конечными производными. На сколько близка эта кривая к идеальной определяется техническими возможностями прибора. Имеется принципиальная неопределенность (тем большая, чем дальше кривая от "идеальной") в том что же считать моментом начала и конца цикла. Создатели прибора определяют это, исходя из своих предпочтений. б) смена температур не происходит мгновенно. Разные приборы имеют разную скорость изменения температуры. Этот факт имеет принципиальное значение для PCR (если бы скачок между 44oС и 72oС происходил "мгновенно", отожженные праймеры просто свалились бы с матрицы. Именно благодаря тому, что Taq pol. успевает удлинить их во время нагрева, они удерживаются.) Как только речь заходит о "температуре в пробирке" появляются дополнительные сложности: Нам кажется, что по "степени влияния" перечисленные выше факторы можно распределить в следующем порядке: * "хорошо" денатурировать матрицу, Проблема в том, что DNA разрушается при нагреве. Скорость разрушения зависит от буфера (при 96.5oC: H2O->2.5'; TE->7.5'; 20mM Tris, pH9.0->~10') Время "полураспада" Taq полимеразы в зависимости от температуры:
Более высокая температура - более высокая специфичность. Но как только она превышает некую критическую (для данной пары праймеров) количество продукта начинает резко снижаться. Обычно мы выбираем температуру отжига на 1-2oС меньше, чем температура плавления олигонуклеотидов. Хотим обратить внимание начинающих пользователей компьютерных программ, что хорошие программы требуют для определения Tm задания двух параметров: * концентрации праймеров; Концентрация соли = [Na+]+[K+]+0.7[Tris]. Для приведённого у нас буфера => 57mM. => В описании этого эксперимента есть важный момент, который нужно иметь ввиду: матрица взята в большом избытке, то есть, полимераза имеет возможность "пренебрегать" неудобными участками синтеза DNA. В реальном процессе полимеразе необходимо пройти все имеющиеся в наличии участки. Оказывается, что при температуре ~65oC синтез существенно меньше зависит от характера матрицы (но даже эта температура слишком велика для буфера с бетаином).
В случае, если решаемая задача не зависит от названных пунктов, пост-PCR этап можно не проводить. 384- и 96-луночные ячейки PCR машины хорошо бы обработать Teflon-spray. Это позволит легко вынимать плашки из машины. Но! предостережение от Алексея Дронова: "Teflon spray не стоит злоупотреблять, а лучше его вообще не применять, так как через некоторое время он образует на плате плохо отмываемый и неприятный слой". Удобно использовать смеси: хранить при -20oС продолжительное время, при 4oС - несколько суток; хранить при -70oС и -20oС продолжительное время, при 4oС несколько недель. Хранить при -70oС и -20oС продолжительное время, при 4oС не более суток. 1х замораживание-оттаивание не меняет эффективность работы Taq полимеразы. Мы применяем два способа: для 0.2-0.5ml пробирок. * заморозить на -20oС. Вода замёрзнет, масло – нет; для 96-луночных плашек фирмы "Techne". * положить плашку на поверхность жидкого азота, дать замёрзнуть и воде и маслу ~5' (масло при этом потрескается); |
Смотри также: /ссылки на сетевые ресурсы/
|
Дополнения, комментарии, вопросы guest: Гость /20.09.2006 20:08/
Тут вопрос возник. При работе на Gradient Palm Cycler стали плавиться рекомендованные стрипы! В чем дело? miniopticon /21.09.2006 11:45/
Если Градиент 105 C- 135 C- то плавятся ))) Guest /21.09.2006 11:48/
добав ь 2-4 пустух стрипа в колонки 1,2 и 11,12 Guest /02.01.2007 14:42/
у авторов кажется "концы с концами" того сначала рисуют "быстрые " температурные переходы и учут - если быстро с 44 нагреть до 72 - то праймер свалится потом пишут что активностъ Так полимеразы при 37 - 1.5 нуклеотида в секунду то есть ПРАЙМЕР уж ТОЧНО протянулся при 44 и не должен СВАЛИТСЯ Guest /02.01.2007 14:55/
еще одно "интересное" утверждение - если пробирка например 0.2 мл то переноси с циклера на циклер и программу не меняй ну-ну АБИ например работают тока в КАЛКУЛАТЕД ТУБЕ КОНТРОЛ то естъ ТАЙМЕР вклучается по температуре СМЕСИ а БИОМЕТРА - толъко по БЛОК КОНТРОЛ и разница может бытъ 20 градусов в момент вклучения таймера! так напереносишся с АБИ на БИОМЕТРУ что пцритъ бросиш навек Guest /02.01.2007 17:22/
(Guest @ 02.01.2007 13:55) еще одно "интересное" утверждение - если пробирка например 0.2 мл то переноси с циклера на циклер и программу не меняй ну-ну АБИ например работают тока в КАЛКУЛАТЕД ТУБЕ КОНТРОЛ то естъ ТАЙМЕР вклучается по температуре СМЕСИ а БИОМЕТРА - толъко по БЛОК КОНТРОЛ и разница может бытъ 20 градусов в момент вклучения таймера! так напереносишся с АБИ на БИОМЕТРУ что пцритъ бросиш навек а если Примусов поимееш - то ПЦРитъ не начнешь ))))))))) Гость /14.01.2008 19:31/
Вопрос от не-биохимика: есть подозрение, что в нашей реакции образуются димеры праймеров (программка предсказывает довольно длинный участок димеризации - более 7-ми нуклеотидов, точно не помню); как я могу проверить, есть у меня димеры или нет? вВ противном случае, будем искать проблему в другом.... Ъ /14.01.2008 20:57/
(Гость @ 14.01.2008 18:31) Вопрос от не-биохимика: есть подозрение, что в нашей реакции образуются димеры праймеров (программка предсказывает довольно длинный участок димеризации - более 7-ми нуклеотидов, точно не помню); как я могу проверить, есть у меня димеры или нет? вВ противном случае, будем искать проблему в другом.... Если все семь букв GC, есть риск вляпаться. Однако, если реакция оптимизирована, проблемы с димеризацией может не будет. Ъ /15.01.2008 10:29/
(Гость @ 14.01.2008 18:31) Вопрос от не-биохимика: есть подозрение, что в нашей реакции образуются димеры праймеров (программка предсказывает довольно длинный участок димеризации - более 7-ми нуклеотидов, точно не помню); как я могу проверить, есть у меня димеры или нет? вВ противном случае, будем искать проблему в другом.... Программа может возмущаться и отбраковать праймеры, но это не значит, что они плохие. Повторюсь, все зависит от того как все у Вас налажено в реакции - реактивы, циклер (циклер немаловажно, иначе от Гостя1 наслушаетесь такой критики ). 7 букв по всему праймеру (если не CG и не подряд) - это обычное дело. А если 3-штрих конец торчит при этом, это даже хорошо. Гость /15.01.2008 12:20/
Спасибо за ответ. Да, реакция была оптимизирована и использовалась в нашей группе не менее 4-х лет (LCR-reaction, plasmid 3,6 kb). Но в руках нового человека с новыми праймерами она перестала работать вообще, даже со старыми "работавшими всегда" праймерами получили только по 1-3 колонии на чашку. Я ломаю голову, что же еще может быть причиной. Нет, не все Г-Ц подряд. Использовали разные полимеразы, разные оптимизированные протоколы для разных полимераз. Yuri K /15.01.2008 16:58/
(Гость @ 15.01.2008 11:20) Спасибо за ответ. Да, реакция была оптимизирована и использовалась в нашей группе не менее 4-х лет (LCR-reaction, plasmid 3,6 kb). Но в руках нового человека с новыми праймерами она перестала работать вообще, даже со старыми "работавшими всегда" праймерами получили только по 1-3 колонии на чашку. Я ломаю голову, что же еще может быть причиной. Нет, не все Г-Ц подряд. Использовали разные полимеразы, разные оптимизированные протоколы для разных полимераз. When your PCR is shaky, a lot of hands-to hands pecularities become important. Among these, I would check the following: 1. How reagents are mixed and kept, on ice or at RT? Adding primers on ice and keeping Master Mix on ice promotes primer-dimers. 2. How long it takes to actually start PCR after the plate/tubes is ready? The longer you keep, the more P-D's you will get. 3. Avoid old primer stocks. Also, whenever you can, even if you use hot-start polymerase, use "false hot start" method. I e, heat the block to 94 and only then place your plate into the block. Yuri K /15.01.2008 17:56/
Also, check the basics. Some poorly trained individuals have no idea they have to shake and spin down anything that has been frozen after thawing. And make sure that after you explained them how to do this they won't start doing it with enzymes in 50% glycerol. Гость /28.11.2008 17:02/
>Хотим обратить внимание начинающих пользователей компьютерных программ, что хорошие программы требуют для определения Tm задания двух параметров: * концентрации праймеров; * концентрации соли. Я обычно использую онлайн-инструмент Ъ /29.11.2008 14:05/
(Гость @ 28.11.2008 16:02) >Хотим обратить внимание начинающих пользователей компьютерных программ, что хорошие программы требуют для определения Tm задания двух параметров: * концентрации праймеров; * концентрации соли. Я обычно использую онлайн-инструмент Халявная программа с дружественным предложением: синтезируйте олиги у нас! DNAstar и DNAsis надо покупать, и не за малые деньги. Но те не занимаются синтезом олигов. watchesbiz /02.01.2022 17:24/
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|