Борьба с загрязнениями при PCR

UV облучение Урацил ДНК гликозилаза Загрязнение поверхностей  Дополнить

Алексей Солдатов Андрей Попов /ВИЖ, Дубровицы/

Дополнения, комментарии, вопросы

_Алишер_ /11.01.2006 03:02/
Сэмплеры (пипетманы)желательно периодически разбирать и промывать, работать в перчатках, не усатраивать сквозняки




Гость /11.01.2006 03:52/
Это к сообщению Андрея Попова из Дубровиц

С чем связано мистическое указание не готовить новую ПЦР, если сегодня гнали форез? Может быть, с фазами луны?




_Cold2_ /11.01.2006 03:56/
По поводу Uracil DNA Glycosylase. Фермент хороший. Но с ним надо быть осторожней. Фермент стоек инактивированию нагреванием. Поэтому надо точно подобрать концентрацию(активность), иначе по ходу амплификаци бидет идти и деградация. А продукты деградации при денатурации превращаются в "праймеры". И вместо ожидаемого продукта получается сплошной шмер. Данное явление можно наблюдать при работе с некоторыми наборами фирмы "Амплисенс"




_poanik_ /11.01.2006 03:58/
(Гость @ 11.01.2006 02:52)
  Это к сообщению Андрея Попова из Дубровиц

С чем связано мистическое указание не готовить новую ПЦР, если сегодня гнали форез? Может быть, с фазами луны?


Всё просто: на одежде, руках, подошвах обуви и т.д. могут остаться продукты ПЦР. Поэтому лучше перестраховаться, чем потом искать источник контаминации.




Гостинец 1 /11.01.2006 14:50/
Ага. Надеть, забинтовать, снова надеть, снова забинтовать, три раза повторить, и ни в коем случае...




Carbon Copy /11.01.2006 19:43/
Мдя... Вы, ребята внесли весомый вклад в развитие литературных жанров городского фольклора и научных баек. Можно, конечно, иногда поприкалываться, но, не до такой же степени! Все эти истории с летающими ампликонами уже надоели хуже горькой редьки. Нужно все-таки знать меру и критически оценивать действительность.

Если быть серьезным, то, чаще всего устранение загрязнений PCR проще и надежнее всего достигается устранением вполне конкретных и определенных личностей, эти загрязнения регулярно привносящих. В отсутствии подобных субъективно-личностных факторов загрязнение PCR, если таковое имеет место быть, устраняется соблюдением элементарных правил, никак не отраженных в материале, любезно предоставленном Алексеем и Андреем, а именно:

1. Никогда не использовать никакой расходный пластик вторично!
2. Использовать только filter tips (носики с фильтрами).
3. Хранить расходный пластик в герметично закрытых банках/коробках.
4. Не лапать никакой расходный пластик руками, доставать из банки/коробки только пинцетом.
5. Всегда следовать золотому правилу молекулярной биологии: один носик – одно пипетирование!
6. Аккуратно открывать PCR пробирки/стрипы/плашки, предотвращая разбрызгивание, для чего их достаточно немного открутить.
7. После применения собирать весь расходный пластик в полиетиленовые пакеты и сразу же выбрасывать.
8. Аликвотить реактивы и растворы небольшими порциями, хранить запасы и реактивы используемые в настоящий момент отдельно.
9. При подозрении на загрязнение реактивов безжалостно выбрасывать все компоненты, использованные в реакции, и начинать с новых аликвот/упаковок.

Желаю успехов!




бутанол /14.01.2006 11:04/
я б добавил о необходимости обработки пинцетов, и более трепетного отношения к таре с носиками (а то забавно смотрятся коллеги выколупывающие носики грязным пинцетом из старой стеклянной банки используемой лет 5 подряд путем добавления в нее новых носиков).




genseq /15.01.2006 09:59/
Основные загрязнители почему-то пропущены. Это форез. И гели, и буфер содержат огромное количество ампликонов. На электродах выделяются пузырьки кислорода и водорода, которые лопаются на поверхности буфера и дают мельчайший аэрозоль, загрязняющий всё помещение.




Carbon Copy /15.01.2006 19:44/
(genseq @ 15.01.2006 06:59)
  Основные загрязнители почему-то пропущены. Это форез. И гели, и буфер содержат огромное количество ампликонов. На электродах выделяются пузырьки кислорода и водорода, которые лопаются на поверхности буфера и дают мельчайший аэрозоль, загрязняющий всё помещение.


Вы это серьезно? Это ж какая концентрация ампликонов должна быть в буфере, чтобы форезным аэрозолем загрязнить все помещение? IMHO это - одна из живучих научных легенд, передаваемых из уст в уста лаборантами/ студентами/ аспирантами и используемых для оправдания элементарной криворукости и неаккуратности. Посудите сами, чтобы ампликоны оказались в буфере, необходимо как минимум, чтобы предыдущий форез убежал и чтобы Вы использовали этот буфер вторично. Как часто это с Вами случается? К тому же давно прошли времена, когда форезные ванночки клеили сами эпоксидкой, все давно гоняют форезы в закрытых аппаратах с крышкой.




Гость /24.08.2006 23:24/
боже, как все запущеноо.....




guest: Гость /04.11.2007 08:02/
"ИМХО это - одна из живучих научных легенд, передаваемых из уст в уста лаборантами/ студентами/ аспирантами и используемых для оправдания элементарной криворукости и неаккуратности. "

Согласна!!!! Особенно это легенда распростроняется в диагностических лабораториях... где ничего нормално не организовано, фиг знает какие реактивы, но виноваты исклучително ампликоны :lol:




Лиснигнах /04.11.2007 08:56/
1. Типсы не стоит держать навалом в банках - есть коробки 96-дырочного формата. Тогда необходимость лапать их хоть руками, хоть пинцетом отпадает в принципе - достаточно ткнуть пипеткой.

2. Поделить лабу на преПЦР и постПЦР зоны, пипетки, коробки с типсами и перчатки туда-сюда не таскать.

3. Пробирки/плашки движутся строго в одном направлении: преПЦР-постПЦР-мусорка. Сиквенсы и т.п. месить на постПЦР зоне. Плашки, заклеенные липкой пленкой, открывать особенно аккуратно - лучше либо в замороженном состоянии, либо сразу после амплификатора (с горячих плашек отстает хорошо) - иначе недолго уделать все и вся вокруг.

4. За нарушения регламента бить морду.




guest: Гость /04.11.2007 13:05/
Интересно... А у нас все в однои комнате и все хорошо проходит. Просто делать надо руками, а не...




Yuri K /05.11.2007 03:31/
Always work only in closed format! FRET rules!




Guest /05.11.2007 11:13/
(Yuri K @ 05.11.2007 03:31)
  Алщаыс щорк онлы ин цлосед формат! ФРЕТ рулес!


Юр - гелъ ставь - полосочки вырезай - клонируй - сиквенируй - ВНУТРИ ЗАКРЫТОЙ
ПРОБИРКИ Ну так прям тебя и представил внутри еппендорфа 0.5 мл
как ты в пробирке копашишся




Yuri K /05.11.2007 18:04/
(Guest @ 05.11.2007 11:13)
  Юр - гелъ ставь - полосочки вырезай - клонируй - сиквенируй - ВНУТРИ ЗАКРЫТОЙ
ПРОБИРКИ  Ну так прям тебя и представил внутри еппендорфа 0.5 мл 
как ты в пробирке  копашишся 


If you can't work in closed format, you need to burn your lab to the ground after each gel you run.

(Just kidding)

The problem of contamination in PCR is not really a scientific problem; it is a problem of poorly trained and/or underpaid personel working in high tech environment.




Ъ /06.11.2007 01:09/
Все подвиги, когда все в одной комнате и одной пипеткой (ужас), это до первой контаминации.
Важно не соблюдение целого ряда (на всю страницу) антиконтаминационных мер, а понимание откуда происходит ЭТО. Меры у вас автоматически сами появятся.




ChainiK /07.11.2007 04:22/
Q: Ну и ещё один "гемморой" как вопрос "что есть сток", а именно, нужно ли чистить ПЦР продукт (длинный кусок 16S rDNA) перед ре-ампилификацией... что скажут корифеи? (слышал версий много - аж 3, придерживаюсь одной)




Guest /07.11.2007 14:05/
(Yuri K @ 05.11.2007 18:04)
  Иф ёу цаньт щорк ин цлосед формат, ёу неед то бурн ёур лаб то тхе гроунд афтер еач гел ёу рун.

(Юст киддинг)

Тхе проблем оф цонтаминатион ин ПЦР ис нот реаллы а сциентифиц проблем; ит ис а проблем оф поорлы траинед андор ундерпаид персонел щоркинг ин хигх теч енвиронмент.


Кстати - могу безплатную рекламу для праймер компаний
"Суицид ПЦР" Самая крутая ПЦР в мире
В основе - ОДНОРАЗОВЫЕ ПРАЙМЕРЫ - сделал ПЦР с одной парой на чуму- "Черная Смерть" - след ПЦР с НОВОЙ парой праймеров чтоб без КОНТАМИНАЦИИ
http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 ( http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 )




Yuri K /07.11.2007 16:28/
(ChainiK @ 07.11.2007 04:22)
  Q: Ну и ещё один "гемморой" как вопрос "что есть сток", а именно, нужно ли чистить ПЦР продукт (длинный кусок 16S rDNA) перед ре-ампилификацией... что скажут корифеи? (слышал версий много - аж 3, придерживаюсь одной)


No. Just dilute it.




Yuri K /07.11.2007 16:33/
(Guest @ 07.11.2007 14:05)
  Кстати - могу безплатную рекламу для праймер компаний 
"Суицид ПЦР"    Самая крутая ПЦР в мире 
В основе - ОДНОРАЗОВЫЕ ПРАЙМЕРЫ - сделал ПЦР с одной парой на чуму- "Черная Смерть" - след ПЦР с НОВОЙ парой праймеров чтоб без КОНТАМИНАЦИИ 
http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 ( http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800 )


I'm not sure I would rely on a system that lacks positive control ;-))




Guest /07.11.2007 17:58/
(Yuri K @ 07.11.2007 16:33)
  Иьм нот суре И щоулд релы он а сыстем тхат лацкс поситиве цонтрол ;-))


в чем проблема ? - в америке добровольцы-бойскауты повывелись?




Guest /09.03.2008 12:14/
А всякие там "PCR cabinet", с ламинарным потоком воздуха, фильтами (ну, разумеется, не ПЦР-продукты, но частицы задерживающими) и УФ - это совсем "лажа"?
Имеется в виду, разумеется, ситуация, когда из раза в раз используется один и тот же "набор" праймеров - и перейти временно на другие ( как, собственно, и проще всего решить проблему в случае загрязнения) не предствляется возможным - по всяким ненаучным соображениям ( вроде GMP документации и т.п. ).




Guest /09.03.2008 21:33/
Начинайте пользоваться dUTP и UDG. Для Вашего случая это много эффективнее чем лам. бокс. Да и подешевле




Guest /10.03.2008 21:03/
(Guest @ 09.03.2008 20:33)
  Начинайте пользоваться dUTP и UDG. Для Вашего случая это много эффективнее чем лам. бокс. Да и подешевле
- конечно, попробовали. Один из восьми регулярно тестируемых в панели "обязательных" амплифицируется значительно хуже уже при переходе на Hotstar, а с dUTP ( в т.ч. и с повышенной концентрацией) практически не виден . Не скажу, чтобы меня донимали и раньше загрязнения - пока не наблюдались, но "от греха подальше " и чтобы ублажить инспекции , раз так рекомендуют, стал работать в этом "скворечнике". Хуже точно не стало - но лучше ли? ведь проблему, вопреки классику жанра, решил "до ее поступления" . Потому и спросил - может, есть такие, что без "ПЦР кабинета" бедствовали", а с ним круто изменилась жизнь?




Гость /15.10.2008 12:04/
срочно нужно освоить пцр,в какой-нибудь лаборатории возможно это сделать за деньги на примере E.coli?????????????




Guest /07.09.2010 07:59/
ага.....все конечно правильно и замечательно, но как бороться с теми, кто считает что ПЦР-ить можно в комнате с электрофорезом, обратной транскрипцией и до кучи с ИФА-методиками ( кстати тут об этом ничего не написано ) а если в преПЦР-ной мойка? а если холодильник для реактивов один на всех и все? что делать?
по поводу УФ - я "освещаю" перед работой все кроме полимеразы и праймеров. минут по 3-4. не знаю правильно или нет.




-Ъ- /07.09.2010 09:57/
(Guest @ 07.09.2010 08:59)
  ага.....все конечно правильно и замечательно, но как бороться с теми, кто считает что ПЦР-ить можно в комнате с электрофорезом, обратной транскрипцией и до кучи с ИФА-методиками ( кстати тут об этом ничего не написано ) а если в преПЦР-ной мойка? а если холодильник для реактивов один на всех и все? что делать?
по поводу УФ -  я "освещаю" перед работой все кроме полимеразы и праймеров. минут по 3-4. не знаю правильно или нет.   


Мадонна, "освещать все" УФ 3-4 мин - это поцелуи через стекло.




RJ Dio /07.09.2010 11:28/
(Лиснигнах @ 04.11.2007 09:56)
  1. Типсы не стоит держать навалом в банках - есть коробки 96-дырочного формата. Тогда необходимость лапать их хоть руками, хоть пинцетом отпадает в принципе - достаточно ткнуть пипеткой.

2. Поделить лабу на преПЦР и постПЦР зоны, пипетки, коробки с типсами и перчатки туда-сюда не таскать.

3. Пробирки/плашки движутся строго в одном направлении: преПЦР-постПЦР-мусорка. Сиквенсы и т.п. месить на постПЦР зоне. Плашки, заклеенные липкой пленкой, открывать особенно аккуратно - лучше либо в замороженном состоянии, либо сразу после амплификатора (с горячих плашек отстает хорошо) - иначе недолго уделать все и вся вокруг.

4. За нарушения регламента бить морду.


к последнему тезису особо присоединяюсь. Все верно. Если кто сомневается- до первого засора и полной дезактивации помещения (если. конечно. задача того требует).




Guest /09.09.2010 09:28/
(RJ Dio @ 07.09.2010 11:28)
  к последнему тезису особо присоединяюсь. Все верно. Если кто сомневается- до первого засора и полной дезактивации помещения (если. конечно. задача того требует).


по тридцать-сорок. на клавиатуре оторвали ноль. гады.




-Ъ- /09.09.2010 09:34/
(Guest @ 09.09.2010 10:28)
  по тридцать-сорок. на клавиатуре оторвали ноль. гады.


А по 30-40 мин - это уже долгий поцелуй,... возможно с засосом , но опять же - через стекло.
Бесполезно. только воздух обеззараживаете и насыщаете всякими вредными радикалами.




VVolkov /09.09.2010 13:09/
Какой ужОСС. Я в начало заглянул. Там же с начала смотреть не на что. Картинки ужасные. А зачем при PCR облучать ультрафиолетом и что облучать? Заново все переписывать нужно.

Борьба с загрязнениями при PCR
UV облучение
Урацил ДНК гликозилаза
Загрязнение поверхностей
Дополнить


Алексей Солдатов
Андрей Попов /ВИЖ, Дубровицы/



Наиболее распространённый способ - UV облучение




VVolkov /09.09.2010 17:48/
Как основоположников - в архив и на постамент! Как все начиналось. Только пыль стирать аккуратно мягкой тряпочкой.






--- страница форума с комментариями --