Типы real-time PCR различаются по способам генерации репортерной флуоресценции. Два основных принципа - это:

1. Применение интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция которых значительно возрастает при связывании с двуцепочечной ДНК,
2. Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку PCR-продукта.

В качестве интеркалирующего красителя наиболее часто используют SYBR Green (рис. 2). В технологиях TaqMan, Molecular Beacons и LightCycler используют меченые олигонуклеотидные пробы.

TaqMan

TaqMan PCR основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-пробы, меченные на 5'-конце флуоресцентным красителем, а на 3'-конце — фосфатной группой и гасителем флуоресценции. Пробы комплементарны участку амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу.

При отжиге праймеров проба количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с пробой, начинает расщеплять пробу за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресценции будет прямо пропорционально количеству наработанного PCR-продукта.

Molecular Beacons

Molecular Beacons отличается от TaqMan тем, что концы пробы (на которых находятся соответственно метка и тушитель флуоресценции) комплементарны друг другу. В результате, при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют структуру типа "ручки сковородки" (stem-loop), где зона комплементарности пробы с матрицей находится в петле.

При гибридизации пробы с матрицей вторичная структура разрушается, флуоресцентная метка и тушитель расходятся в разные стороны, и флуоресценция от метки может быть детектирована.

Light Cycler

В этой методике используется две пробы, меченые флуоресцентной меткой. Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3' конце первой пробы, ко второму флуорофору, находящемуся на 5' конце второй пробы, который происходит в том случае, когда расстояние между флуорофорами составляет 1-3 нуклеотида.

2. Типы real-time PCR