MolBiol.ru > Методы > Real-time PCR > Оценка качества | |
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|
8. Оценка качества реакции
Оценку качества реакции проводят по следующим параметрам: Ниже мы рассмотрим каждый из этих пунктов более подробно, а в гл. 10 покажем возможные алгоритмы разрешения трех основных проблем: (i) димеры праймеров при работе с SYBR Green, (ii) низкая достоверность обсчёта, (iii) низкая эффективность реакции. 8.1. Анализ формы кинетической кривой Кинетическая кривая PCR в координатах "уровень флуоресценции - цикл амплификации" должна иметь сигмовидную форму. Именно это нужно первым делом проверить. Рассмотрим случаи, когда форма кривой отклоняется от сигмовидной: Также рекомендуется сразу же, не проводя расчёта, посмотреть на кривую в контроле "только праймеры (и проба)". Если уровень флуоресценции превышает baseline, в случае TaqMan это почти однозначно свидетельствует о загрязнении. В случае SYBR Green весьма вероятно, что это связано с образованием димеров, что выявляется анализом кривой плавления. 8.2. Анализ кривой плавления Мы рассмотрим только анализ кривой плавления при работе с SYBR Green. Кривая должна быть построена в диапазоне температур от температуры отжига (при более низких температурах это делать не имеет смысла) до температуры полной денатурации - примерно 95OC. Обычно кривая строится по окончании реакции, однако некоторые машины умеют делать это и в процессе амплификации. Это иногда бывает удобно для выявления цикла, на котором появилась неспецифика, хотя это обычно можно увидеть и при анализе кинетической кривой. Анализировать кривую удобнее всего в координатах dI/dT (скорость изменения интенсивности флуоресценции от температуры), при базовом уровне, равном минимуму во всем диапазоне данных (minimum over all data). В идеальном случае, в реакциях с матрицей мы должны наблюдать один пик (соответствующий плавлению специфического продукта), а контроль "праймеры без ДНК" - слабые, затухающие стохастические колебания во всем диапазоне температур. Рассмотрим случаи, когда кривая плавления отличается от желаемой. 8.3. Определение достоверности околичествления Из уравнения 3:C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E (3)
следует, что результаты real-time PCR с данной парой праймеров (зондом) и серийными разведениями субстрата должны ложиться на прямую в координатах С(T) - logP0, а эффективность амплификации E можно определить из угла наклона прямой. В качестве P0 может выступать и относительная концентрация - например, концентрацию субстрата в наименьшем разведении можно принять за 1. Как правило, управляющая программа real-time PCR сама может выполнить линейную регрессию (метод наименьших квадратов), в противном случае это легко можно сделать в Excel. Для этого нужно построить график зависимости С(T) - logP0, щелкнуть правой клавишей мыши непосредственно по кривой, выбрать Add trendline (в русской версии Добавить линию тренда), выбрать линейную аппроксимацию, а в закладке Параметры выбрать опции Показать уравнение на диаграмме и Поместить на диаграмму величину достоверности аппроксимации (R^2). Какую достоверность считать приемлемой? Это зависит от концентрации субстрата и от задач эксперимента. В диапазоне C(T) 20-30 желательно, чтобы R2 > 0.99. Cо сверхнизкими концентрациями этого удается добиться далеко не всегда, но по крайней мере желательно, чтобы достоверность линейной аппроксимации зависимости "Средние значения C(T) - logP0" была не меньше 0.975-0.98 (как уже было сказано выше, если необходимо работать со сверхнизкими концентрациями, то следует проводить как минимум 2-3 повтора отладочного эксперимента). О том, какие факторы могут негативно влиять на достоверность околичествления написано в разделе Разрешение проблем. 8.4. Определение эффективности амплификации Из уравнения 3 видно, что эффективность реакции можно рассчитать как E = 10-1/k, где k берется из уравнения прямой C(T) = k·log P0 + b, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При E = 2 (максимально теоретически возможном значении) k ~ -3.32. Значения k < -3.32 соответствуют более низкой эффективности реакции. Желательно добиваться таких условий реакции, в которых эффективность амплификации составляет, по меньшей мере, 1.7 - 1.8 (k не меньше -4 — -4.2) - о возможных путях повышения эффективности см. в разделе Разрешение проблем. С другой стороны, иногда k оказывается больше, чем -3.32, что соответствует теоретически невозможной ситуации E > 2. Небольшое превышение (-3.32 < k < -2.8) наблюдается относительно часто и может быть отнесено на счет погрешности измерений. Примечания
|
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|