Главная страница MolBiol.ru > Методы > Real-time PCR > Оценка качества Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

8. Оценка качества реакции

a11


    Оценку качества реакции проводят по следующим параметрам:
    • форме кинетической кривой PCR,
    • специфичности амплификации, определяемой из кривой плавления (для SYBR Green),
    • достоверности околичествления,
    • эффективности амплификации.

    Ниже мы рассмотрим каждый из этих пунктов более подробно, а в гл. 10 покажем возможные алгоритмы разрешения трех основных проблем: (i) димеры праймеров при работе с SYBR Green, (ii) низкая достоверность обсчёта, (iii) низкая эффективность реакции.



    8.1. Анализ формы кинетической кривой

    Кинетическая кривая PCR в координатах "уровень флуоресценции - цикл амплификации" должна иметь сигмовидную форму. Именно это нужно первым делом проверить.


    Рассмотрим случаи, когда форма кривой отклоняется от сигмовидной:


    1. Уровень флуоресценции до начала экспоненциальной фазы постоянно возрастает. В этом случае нужно пересмотреть способ выбора baseline. Если это не помогает, необходимо ввести контроль "только PCR-mix без праймеров" (blank) и проанализировать наблюдаемый уровень флуоресценции. Возможно, вычитание этого уровня (subtract blanks) решит проблему.
       
    2. Не наблюдается стадии насыщения (плато). Такой эффект вполне допустим при работе со сверхмалыми концентрациями субстрата, однако если он наблюдается и при больших концентрациях, это говорит о низкой эффективности реакции.
       
    3. В экспоненциальной фазе кинетические кривые PCR, полученные с разными разведениями субстрата и той же парой праймеров, не параллельны друг другу. Самый частый случай - это когда при бóльших концентрациях матрицы стадия насыщения наступает раньше, что говорит о дефиците пробы или праймеров.
      Однако иногда это может также быть вызвано различной концентрацией компонентов PCR или примесей в реакционной смеси, что приводит к различной эффективности PCR в реакциях. Сравнивать такие данные некорректно. Проблему можно попробовать разрешить, увеличив объем реакционной смеси.
      Если пересечения наблюдаются достаточно поздно - при уровнях репортерной флуоресценции, значительно превышающих порог, на них можно не обращать внимания. Если кривые пересекаются лишь в самом начале экспоненциального роста (при превышении над baseline, скажем, на 0.05), необходимо выбрать значения порогового уровня выше пересечений. Если пересечения наблюдаются на всем протяжении экспоненциальной фазы, это, скорее всего, это говорит о плохо откалиброванном оборудовании.
       
    4. На протяжении экспоненциальной фазы наблюдается несколько значительных переломов. Этот эффект свидетельствует о том, что детектируется не одна, а сразу несколько реакций, протекающих с различной эффективностью - либо образуется и детектируется несколько PCR-продуктов, либо димеры праймеров. В подавляющем большинстве случаев это недопустимо.

    Также рекомендуется сразу же, не проводя расчёта, посмотреть на кривую в контроле "только праймеры (и проба)". Если уровень флуоресценции превышает baseline, в случае TaqMan это почти однозначно свидетельствует о загрязнении. В случае SYBR Green весьма вероятно, что это связано с образованием димеров, что выявляется анализом кривой плавления.



    8.2. Анализ кривой плавления

    Мы рассмотрим только анализ кривой плавления при работе с SYBR Green. Кривая должна быть построена в диапазоне температур от температуры отжига (при более низких температурах это делать не имеет смысла) до температуры полной денатурации - примерно 95OC.


    Обычно кривая строится по окончании реакции, однако некоторые машины умеют делать это и в процессе амплификации. Это иногда бывает удобно для выявления цикла, на котором появилась неспецифика, хотя это обычно можно увидеть и при анализе кинетической кривой. Анализировать кривую удобнее всего в координатах dI/dT (скорость изменения интенсивности флуоресценции от температуры), при базовом уровне, равном минимуму во всем диапазоне данных (minimum over all data).


    В идеальном случае, в реакциях с матрицей мы должны наблюдать один пик (соответствующий плавлению специфического продукта), а контроль "праймеры без ДНК" - слабые, затухающие стохастические колебания во всем диапазоне температур.


    Рассмотрим случаи, когда кривая плавления отличается от желаемой.


    1. В контроле (но не в опыте) наблюдается широкий пик в районе 80 градусов. Так обычно выглядит кривая плавления димеров праймеров. Если в опытных образцах такой пик не наблюдается, это значит, что образование димеров является значительно менее выгодным, чем образование продукта, и таким образом, вряд ли значительно повлияет на эффективность реакции.
      Если пики, соответствующие продукту и димерам, разрешаются, то от вклада димеров в репортерную флуоресценцию можно избавиться путем "страусинной политики", то есть определяя ее при температуре (назовем ее Tread) выше температуры плавления димеров, но ниже температуры плавления продукта (подробнее см. ниже - Разрешение проблем). Так же вполне можно поступить и в том случае, когда димеры возникают и в присутствии сверхмалых концентраций матрицы.
      Если димеры наблюдаются и при высоких концентрациях матрицы, от них желательно избавляться методами, отличными от "страусинной политики" - например, заказать новые праймеры (о других методах см. ниже). К "страусинной политике" нельзя прибегать также и в том случае, если пики продукта и димеров не разрешаются.
       
    2. В образце с матрицей наблюдается несколько пиков, не присутствующих в контроле. Это говорит о том, что в реакции образуется больше одного продукта. Лишь в одном случае от этой проблемы можно избавиться путем "страусинной политики": если a) температура плавления "неспецифического" продукта ниже температуры плавления нужного продукта и б) эффективность образования продукта интереса значительно превышает эффективность образования "неспецифики". В остальных случаях нужно либо заказать новые праймеры, либо провести стандартную оптимизацию PCR.

    8.3. Определение достоверности околичествления

    Из уравнения 3:
    C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E     (3)

    следует, что результаты real-time PCR с данной парой праймеров (зондом) и серийными разведениями субстрата должны ложиться на прямую в координатах С(T) - logP0, а эффективность амплификации E можно определить из угла наклона прямой. В качестве P0 может выступать и относительная концентрация - например, концентрацию субстрата в наименьшем разведении можно принять за 1.

    Как правило, управляющая программа real-time PCR сама может выполнить линейную регрессию (метод наименьших квадратов), в противном случае это легко можно сделать в Excel. Для этого нужно построить график зависимости С(T) - logP0, щелкнуть правой клавишей мыши непосредственно по кривой, выбрать Add trendline (в русской версии Добавить линию тренда), выбрать линейную аппроксимацию, а в закладке Параметры выбрать опции Показать уравнение на диаграмме и Поместить на диаграмму величину достоверности аппроксимации (R^2).

    Какую достоверность считать приемлемой? Это зависит от концентрации субстрата и от задач эксперимента. В диапазоне C(T) 20-30 желательно, чтобы R2 > 0.99. Cо сверхнизкими концентрациями этого удается добиться далеко не всегда, но по крайней мере желательно, чтобы достоверность линейной аппроксимации зависимости "Средние значения C(T) - logP0" была не меньше 0.975-0.98 (как уже было сказано выше, если необходимо работать со сверхнизкими концентрациями, то следует проводить как минимум 2-3 повтора отладочного эксперимента). О том, какие факторы могут негативно влиять на достоверность околичествления написано в разделе Разрешение проблем.



    8.4. Определение эффективности амплификации

    Из уравнения 3 видно, что эффективность реакции можно рассчитать как E = 10-1/k, где k берется из уравнения прямой C(T) = k·log P0 + b, полученного путем линейной аппроксимации экспериментальных данных. При E = 2 (максимально теоретически возможном значении) k ~ -3.32.

    Значения k < -3.32 соответствуют более низкой эффективности реакции. Желательно добиваться таких условий реакции, в которых эффективность амплификации составляет, по меньшей мере, 1.7 - 1.8 (k не меньше -4 — -4.2) - о возможных путях повышения эффективности см. в разделе Разрешение проблем.

    С другой стороны, иногда k оказывается больше, чем -3.32, что соответствует теоретически невозможной ситуации E > 2. Небольшое превышение (-3.32 < k < -2.8) наблюдается относительно часто и может быть отнесено на счет погрешности измерений.



    Примечания
    1. Эффективность амплификации можно рассчитать и без использования серийных разведений - путем анализа кинетической кривой. См. Tichopad et al., NAR, 2003.
    2. Воспроизводимость результатов возрастает с увеличением эффективности амплификации (Tichopad et al., Biotechnol. Lett, 2002).



    предыдущая часть 8. Оценка качества реакции следующая часть




MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 27276




    Дополнения, комментарии, вопросы





       
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler