2' на температуре > 65oC, медленно остудить до <35oC (15-30'), сразу в лед;
к смеси отжига добавить разбавленный Lab. mix по 2.75µl;
NT(~18oC), 2-5';
во время мечения поставить пробирки с терминирующими смесями в ЦФ; за 30'' до конца мечения открыть крышки;
по 1.8µl в терминирующие пробирки ;
37oC, 5';
70oC, 10';
0oС, ~2';
+ 2µl "Stop".
0oС;
непосредственно перед нанесением на гель: 80oС, 2', затем сразу в лед ~ 2'.
Для dsDNA
На наш взгляд более удобен метод щелочной денатурации.
приготовить смесь:
pDNA 3.25µl => (0.5-1µg),
Primer/NaOH => 0.75µl;
37oC 10';
+ 1µl нейтрализующего раствора;
сравнить цвет с серией стандартов: нужно, чтобы pH был в районе 7.0-8.0, для коррекции добавлять по 0.1µl 0.1M NaOH (или HCl);
37oC 5';
далее, начиная с п. 3 для ssDNA.
Альтернативный метод – тепловая денатурация
Сообщалось, что если проводить денатурацию в присутствии буфера, то получится высокий фон и шмер; если добавлять буфер после денатурации, то все нормально (на наш взгляд, очень странно):
Нормальный темп охлаждения - если используется 0.5L стакан со 100ml H2O.
п. 3.
Если матриц для сиквенса не слишком много (~10-15), удобно подписывать терминирующие пробирки во время отжига. Если их больше - лучше сделать это заранее.
Мы предпочитаем подписывать пробирки для отжига и терминирующие пробирки циклически, чередуя фломастеры 4х различных цветов (каждая матрица/ терминирующая пробирка имеет свой соответствующий цвет, чтобы не запутаться при манипуляциях).
п. 4.
a[33P]dATP - от 0.25µl до 0.5µl в зависимости от свежести метки.
Мы используем смесь Sequenase*:Tag pol.=20u:1u (*разведённая в глицерол-содержащем буфере). Tag pol. работает в п. 10; её функция – продолжить места неспецифической остановки Sequenase. Такая модификация протокола весьма проста, но даёт очень хорошие результаты – мы практически никогда не сталкиваемся со "strong stop’s".
п. 14.
Сообщалось, что добавление DMSO до 10% на этапах мечения и терминации или Formamide 10% на этапе отжига, способны существенно улучшить сиквенсовую картинку (Sequenase спокойно выдерживает присутствие 10% formamide).
Образцы c 35S и 33P могут храниться неделю при -20°C. Образцы с 32P должны быть разогнаны на форезе в тот же день.
п. 15.
Внимание! При приготовлении ds pDNA для сиквенса endA+ штаммы дают никованную DNA, которая приводит к появлению "фоновых полос" на сиквенсовом геле. Лучше использовать endA- штаммы типа DH5a, SURE, JM109, JM105.