Источник: S. O. Rogers & A. J. Bendich Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5; 69-76, 1985 (с модификациями).
Листья можно хранить при -70оС.
Выход: в зависимости от типа ткани: 0.3 - 200ng DNA на 1mg ткани. В наших руках из листьев арабидопсиса получалось 80ng/mg. Наибольший выход из эмбрионов и листьев, наименьший - из органов хранения крахмала.
Получается ДНК размером 40 - 70kbp. Годится для рестрикции и PCR.
Автор методики не является специалистом по работе с растениями, но работала с этой методикой и она понравилась. Поэтому, если у кого-то есть комментарии или какие-то другие способы, было бы приятно о них узнать.
По пунктам
п. 1 - 3.
Видимо, если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в ступку и растирать и его тоже. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифужных пробирок (в этом случае имеет смысл добавлять ~20µg tRNA как носитель).
п. 7.
Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях требуется добавить 1хCTAB буфер до исходного объёма.
Дополнение о подготовке растений.
Ким Елена (kimuch_xx1@mail.ru), магистрантка каф. Цитологии и гистологии СПбГУ, БИН РАН - лаб. Биосистематики и цитологии.
Если нет жидкого азота, то ткань можно высушить в термостате на +37oC (пока она не станет хрупкой), затем перетереть в тонкий порошок в обычной лабораторной ступке диаметром до 10cm с минимальным количеством оксида алюминия (минимальное количество - так чтобы не прилипало к пестику и дну ступки). Для выделения брать около 0.5ml (в 1.5ml пробирке Эппендорф). Если не вся ткань перетерта, хранить её можно при комнатной температуре в новом полиэтиленовом пакетике с пластиковой застежкой.
Этот метод я применяла для широкого спектра растительных объектов в пределах Лилейных, Амариллисовых, Аспарагусовых и пр. В основном использовалась ткань листьев. Выделенная ДНК использовалась для блот/дот-гибридизации, ПЦР.
Можно выделять аналогичным способом ДНК из совсем небольших количеств материала - 20-150 мг. Измельчение производится прямо в эппендорфе спец. пестиком или заплавленным типом на 1000 мкл. Метод работал с лиственничной хвоей - в сухом виде, свежей и замороженной, а также с проростками лиственницы, кукурузы, пшеницы и пр. Единственное - тонкостенные пробирки при экстракции хлороформом разрывало в центрифуге, так что следует подбирать качественные эппендорфы - Treff, Axygen и т.п.
Гость/14.07.2005 14:18/
Метод хороший и мы использовали его много раз .Но бывает примесь РНК.
Fox/16.07.2005 20:07/
Метод хороший и если качество устраивает можно значительно сокращать время и количество шагов. Отлично работает на моллюсках (есть и коммерческий кит) и головастиках с добавлением ProK на стадии перевара. Из свежего материала всегда получается много РНК.
Saveta/10.10.2005 11:29/
Метод хороший. Пошел и на грибах. Работали на микрокол-вах. Пришлось (по материальным причинам) исключить пункт 17 и использовать чистый Хлороформ (насыщенный водой) вместо смеси. А когда пришлось работать без азота, растирала свежий мицелий с буфером - и несмотря на все это - получалось норамально.
Cerevisia/12.10.2005 14:09/
После инкубации на 65 (30 мин) добавляю равный обьем фенол:хлороформ (1:1), мешать, центрифугировать, снять верхнюю фазу. Добавить равный обьем хлороформа, мешать, центрифугировать, снять верхнюю фазу. Осаждать 0.75 обьемом изопропилового спирта - 10 мин при комнатной температуре. Осадить, осадок промыть этанолом 70%. ДНК годится для ПЦР. При желании можно почистить РНКазой и повторить фенольно-хлороформную очистку.
Гость/06.02.2007 18:58/
У меня токой вопрос. После осаждения ДНК с изопропанолом и центрифугирования, я осадок (ДНК) оставил на ночь в CH3COONa+спирт 76%. Потом отцентрифугировали и добавили воды, но ДНК не растворился. Добавили понемногу больше воды, но полюбому не получилось. Какова может быть причина? (метод Murrey-Thompson)
ада/29.06.2007 03:23/
привет а у меня вопрос подскажите пожалуйста где искать выделение днк из фитофторы ну очень нужно
Grumeza Radu/04.07.2007 11:17/
(Гость @ 06.02.2007 16:58)
У меня токой вопрос. После осаждения ДНК с изопропанолом и центрифугирования, я осадок (ДНК) оставил на ночь в CH3COONa+спирт 76%. Потом отцентрифугировали и добавили воды, но ДНК не растворился. Добавили понемногу больше воды, но полюбому не получилось. Какова может быть причина? (метод Murrey-Thompson)
У вас там Polysaccharides завелись (или другие примеси), днка дуба, розы итгд имеют ету неприятную особенность. Растворяется водой (Ph8) 1-3 hours at 65-75 degrees celsius
Гость/06.02.2008 13:39/
Как очистить ДНК,выделенную из проростков пшеницы, с низким показателем чистоты - 1,1405?
Гость/30.08.2008 14:19/
Скажите а сколько можно хранить растворы с ЦТАБ???
Cerevisia/02.09.2008 12:09/
(Гость @ 30.08.2008 11:19)
Скажите а сколько можно хранить растворы с ЦТАБ???
смотря как хранить и для чего. Для пцр<1000 нк храню в холодильнике при +4 до двух месяцев. Для длинных пцр замораживаю и храню на - 20 до полугода.
Гость/07.10.2008 06:19/
Большое спасибо!!!
Guest/07.10.2008 13:00/
Aschenputtel/01.03.2009 00:39/
Этот метод пригоден не для всех видов растений. Из растнений, которые содержат большое количество полифенольных соединений (или еще какой-то дряни) этим методом выделять невозможно, точнее, выделенная этим методом ДНк требует дополнительной очистки
guest: Николай /12.03.2009 21:18/
Есть мнение, что в ткани растений подготовленной для выделения ДНК высушиванием, начинают работать ДНК-аза и другие активности. Значит будут потери и искажения результатов. Что ученый народ скажет о таком методе?
mlog/12.03.2009 21:24/
(guest: Николай @ 12.03.2009 21:18)
Есть мнение, что в ткани растений подготовленной для выделения ДНК высушиванием, начинают работать ДНК-аза и другие активности. Значит будут потери и искажения результатов. Что ученый народ скажет о таком методе?
Не замечала никаких отрицательных эффектов, если быстро высушить. Иногда даже специально высушиваю - не люблю из свежего материала ДНК выделять.
Ъ/13.03.2009 10:16/
(mlog @ 12.03.2009 20:24)
Не замечала никаких отрицательных эффектов, если быстро высушить. Иногда даже специально высушиваю - не люблю из свежего материала ДНК выделять.
Специально сушите материал? А выделяете ДНК каким методом из "гербария"?
mlog/13.03.2009 16:42/
(Ъ @ 13.03.2009 09:16)
Специально сушите материал? А выделяете ДНК каким методом из "гербария"?
Как-нибудь вот так: или киагеновским/любым аналогичным китом. Именно что из гербария - я же ботаник по образованию, это у меня ещё с курсовой привычка
Ъ/13.03.2009 17:42/
(mlog @ 13.03.2009 15:42)
Как-нибудь вот так: или киагеновским/любым аналогичным китом. Именно что из гербария - я же ботаник по образованию, это у меня ещё с курсовой привычка
Эта методика не для ленивых - вот что я вам скажу. Попробуйте плавно перейти вот на эту методику, которую наша девушка там, в Канаде, опубликовала:
mlog/13.03.2009 18:33/
(Ъ @ 13.03.2009 17:42)
Эта методика не для ленивых - вот что я вам скажу. Попробуйте плавно перейти вот на эту методику, которую наша девушка там, в Канаде, опубликовала:
Ой, а не пришлете мне статью? А то тут нет доступа (fagopyrum -at- list.ru) А один из авторов, Hebert - это баркодер, что ли?
Ъ/13.03.2009 18:39/
(mlog @ 13.03.2009 17:33)
Ой, а не пришлете мне статью? А то тут нет доступа (fagopyrum -at- list.ru) А один из авторов, Hebert - это баркодер, что ли?
Кто такой Hebert, спросите у Наташи. Мария, Вам придется мыло выставлять для фултекста.
mlog/13.03.2009 18:49/
Так я же написала - fagopyrum@list.ru просто @ на -at- заменила, как это обычно делают.
Ъ/13.03.2009 18:51/
(mlog @ 13.03.2009 17:33)
Ой, а не пришлете мне статью? А то тут нет доступа (fagopyrum -at- list.ru) А один из авторов, Hebert - это баркодер, что ли?
MolBiol.ru >
Методы >
Геномная ДНК > Выделение ДНК из растений
Zbio-wiki
Дополнить
