Достоинства: очень дешевая и эффективная протеаза. Метод хорошо работает на мухах и их тканях, не вижу препятствий для использования в других целях. Недостатки не отмечены.
По пунктам
п. 2.
Если ткани не очень "крепкие", можно это делать с помощью инсулинового шприца на 1ml (с иглой толщиной 0.4mm) сразу в 700µl LB.
п. 3.
Если не жалко, можно и больше, лишь бы RNase была хорошая (DNase free).
п. 4.
Dispase II (Roche #165859), 5g фасовка стоит 123€(!). Готовится как стоковый раствор 100mg/ml. Инкубировать 1.5h на 37oC, после чего можно использовать. Лучше всегда делать свежую, хранить на +4oC не больше недели (советую не хранить). Я добавляю 15-20µl этого раствора на одну реакцию и инкубирую ON.
п. 5.
Если не нужны особо длинные молекулы, можно поболтать вполне ощутимо. Чем мельче будут капли фенола в водной фасе, тем чище будет DNA на выходе.
п. 7.
Можно осаждать при -20oC или -70oC 1h и 15', соответственно.
п. 8.
Осадок после преципитации должен быть нормальным, светлого цвета. Если выпал не осадок, а полужидкая сопля, вам её не удастся промыть как следует, и DNA будет с грязью. В этом случае помогает несколько раз помыть 70% спиртом, интенсивно взбалтывая до тех пор, пока сопля не разболтается в спирте и после очередного центрифугирования не превратится в нормальный осадок. С DNA от этого ничего страшного не произойдет. После этого надо промыть 96%EtOH и растворить. Если ничего не помогает, надо растворить как есть и переосадить ещё раз с NaOAc.
MolBiol.ru >
Методы >
Геномная ДНК > Выделение ДНК из культуры клеток
Zbio-wiki
Дополнить