(не обязательно) проверить, что pH формальдегида >4.0;
расплавить соответствующее количество агарозы в H2O, лишь затем добавить 50xFGRB и формальдегид:
охладить до <60oС, залить гель под тягой;
приготовить форезный аппарат:
приготовить RNA, смешав из расчёта:
RNA (в H2O) => 3µl
"RNA loading mix" => 7µl;
65oС 15', сразу в лёд на 2-5';
к каждому образцу добавить 1/10V "RNA gel buffer";
префорез 5' ~5V/cm, нанести образцы, форез в тех же условиях;
Перенос
частично отмыть гель от формальдегида в H2O (в ~300ml 30');
уравновесить в 20xSSC (в ~300ml 30');
поставить перенос в этом же SSC;
зафиксировать RNA на мембране UV (хранить завёрнутой в SaranWrap при -20oС);
Гибридизация
предгибридизация в HSB(f+) 50oС, ~30';
гибридизация 50oС, ON (для гибридизации использовать тот же буфер, что использовался для предгибридизации, добавив в него меченный зонд);
Отмывка
(I) 2х 15', NT-68oC
(II) 2х 20-25', 68oC
Отшпаривание
после экспозиции отшпарить метку в кипящем 0.5% SDS (довести 0.5% SDS до кипения, погрузить в кипящий раствор мембрану, кипятить 0.5-1'; оставить при NT на качалке на 20-30'. Затем - дать стечь жидкости, завернуть в SaranWrap (хорошо бы провести контрольную экспозицию) и хранить при -20oС.)
вместо 2% Blocking Reagent ("Roche Diagnostics GmBH; бывший Boehringer Mannheim" #1 096 176) можно использовать 10x Denhardt или сухое обезжиренное молоко.
Blocking Reagent можно растворить, лишь в буфере с высокой ионной силой (в данном случае - в H2O+SSC+NaP).
Salmon sperm DNA должна быть раздробленной и денатурированной.
Про pH формальдегида написано во всех методиках, однако, мы вполне успешно пользовались формальдегидом с pH в районе 4.0.
п. 2, 3.
Делать это надо под тягой: пары формальдегида весьма и весьма неприятны.
п. 4.
Лучше использовать для Нозернов отдельную камеру. В этом случае ее достаточно сполоснуть водой перед электрофорезом. Если камера грязная или из ненадежного источника, надо вымыть детергентом, сполоснуть mQ, сполоснуть ~ 15-30' 2% H2O2(~10') и затем вновь сполоснуть mQ.
Форез проводят так, чтобы форезный буфер не попадал на верхнюю поверхность геля. В противном случае формальдегид будет диффундировать из геля, возникнет неоднородность его концентрации по толщине геля, => полосы RNA будут наклоняться, а при переносе - расширяться. SaranWrap используют для того, чтобы поверхность геля не подсыхала во время фореза.
п. 5.
Нужно помнить, что существует два различных "RNA loading mix" - для маркера и для образцов. Концентрация EtBr в RNA loading mix для маркера увеличена в 10 раз, это позволяет наблюдать 8 полос при суммарной массе 0.2µg. Делать такую же концентрацию в буфере для образца нельзя, т.к. высокая концентрация EtBr снижает эффективность гибридизации.
Смесь с "RNA loading mix" можно хранить неограниченное время при -70oС.
п. 6.
Денатурация возможных двухцепочечных структур в RNA и химическое взаимодействие RNA с формальдегидом. Вторая реакция (в отличие от первой) требует вполне заметного времени, так что сокращать указанные в методике 15' не стоит. Быстрое охлаждение до 0oС имеет следующий смысл. Для образования двухцепочечной структуры требуется некая начальная "энергия активации". При 0oС молекуле сложнее раздобыть эту энергию. Таким образом, хотя двухцепочечная структура тем более стабильна, чем ниже температура, образоваться при 0oС она не может.
п. 8.
Если интересует mRNA "всех" размеров, то форез проводить до тех пор, пока бромфеноловый синий не дойдёт приблизительно до 4/5 геля (он идёт в районе ~100b RNA).
Лучше использовать нейлоновую мембрану. Нейтральную или положительно заряженную (Hybond N или Hybond N+) - всё равно.
п. 13.
Очень важно, чтобы мембрана оставалась влажной с п.13 по п.17. Особенно легко подсушить мембрану во время экспозиции, поэтому мы рекомендуем всегда проводить экспозицию при -20 - -70oС.
п. 15.
Отмывку (I) можно проводить при любой температуре от NT до 680C.
п. 16.
Для горячей отмывки (II) мало поместить стакан с мембраной в горячий гибридайзер. Раствор для отмывки нужно заранее довести до 680C и заливать в стакан уже горячим (лучше заливать в два приёма – первой порцией сполоснуть гибридизационный стакан от старого буфера и одновременно подогреть его, а второй порцией отмывать мембрану указанное время).
MolBiol.ru >
Методы >
RNA > Формальдегидный форез - Northern
Zbio-wiki
Дополнить