клетки (обычно LE 392) вырастить в ТВ/Mg/мальтоза 30oC, ON;
чашки с нижним LTB/Mg агаром поставить на 37oС на 1h;
верхний LTB/Mg агар (из расчёта по 3.5ml на чашку d=8cm) расплавить, охладить до 47oС (держать в водяной бане 47oС);
приготовить общую смесь фаг лямбда+клетки (из расчёта на отдельную d=8cm чашку ~40µl клеток и не более 12 000pfu фага лямбда);
37oС, 20' не качая;
смесь фаг лямбда+клетки (п.5) перенести в верхний агар (п.3), смешать;
быстро разлить пипеткой по 3.5 ml на чашку.
Снятие реплик
чашки охладить 4oС (1h);
мембраны подписать карандашом;
накладывать мембраны надписью вверх так, чтобы номер на мембране находился над надписью на чашке;
оставить на 5';
иглу прокалить, ~5 раз проткнуть мембрану и агар равномерно по площади (но не по периметру) чашки. Следить, чтобы проколы были вертикальными и не попадали на надпись на чашке;
снять фильтр, зацепив пинцетом с той стороны, которая находится ближе всего к бортику чашки;
если требуется, аналогичным образом (п.1-6) снять вторую (третью, четвертую) реплики, каждую следующую держать на чашке на ~3' дольше, чем предыдущую;
денатурация ~5' (не более 10'!!!);
промакнуть на фильтровалке;
нейтрализация >=5';
промакнуть на фильтровалке;
прижечь UV;
5-10' полоскать в 4хSSC. Если пристали кусочки агара, снять их в 4хSSC стеклянным шпателем, обернутым марлей;
высушить фильтры, хранить при NT, чашки хранить ~2 месяца на +4oС.
Гибридизация
можно проводить как в гибридайзере, так и в чашке Петри, помещённой в качающуюся баню (накрыть перевернутой крышкой, сверху – грузик; гибридизационного буфера должно быть достаточно много, чтобы мембраны не слипались). После гибридизации гибридизационный буфер не выбрасывать – он пригодится для проведения вторичного скрининга.
Отмывка
(I) 3-4х 10', NT-68oC:
(II) 2х 20-25', 68oC:
Вторичный скрининг
выколоть бляшку в 800µl SM + 2 капли хлороформа, вортекс;
либо интенсивно качать 37oС 2h, либо 4oС без качания ON;
ЦФ, развести 2µl суспензии фага в 1ml SM;
контрольный высев:
1µl разведённого фага (из п.27) + 5µl культуры клеток,
37oC, 20',
+ 100µl верхнего LB/Mg агара, смешать, нанести на чашку с нижним LB/Mg агаром,
бляшки появляются через 6-8 часов;
рассчитать титр фага и провести препаративный высев (~100-200 бляшек на чашку).
Или 37oC - не долго, чтобы не доводить до насыщения.
Для первичного высева лучше использовать, если это возможно, клетки, обеспечивающие селекцию против вектора без вставки.
п. 2.
Чашки прогреваются для того, чтобы не было проблем, связанных с преждевременным застыванием верхнего агара.
Для чашек используется LТВ агар, т.к. использование бедной среды уменьшает размер бляшек.
Очень важно заливать чашки и разливать верхний агар на строго горизонтальной поверхности, иначе плотность высева будет очень неравномерной. или, если уж приходится делать это на не выровненной поверхности, то чашки должны находиться в одном и том же положении - для контроля надо сделать отметки на бортиках.
п. 3.
Однажды у нас была банка с бакто-агаром, который начинал застывать при 47oС. Выход из этой ситуации - сменить агар, а тот, который застывает, использовать для приготовления нижнего агара.
п. 5.
Адсорбция фага лямбда на клетки, проникновение внутрь. Превышение времени инкубации чревато тем, что какой-нибудь фаг лизирует клетку и успеет размножиться. В некоторых методиках для синхронизации заражения, клетки с фагом держат без встряхивания при 0oC 25' - адсорбция, а затем при 37oC 5' - проникновение.
п. 8.
Чтобы агар стал более твердым и мембрана не прилипла. Попытка заменить {1h при 4oС} на {5' при -20oC} приведёт к тому, что поверхность агара станет мокрой.
п. 10.
На самом деле важно только, чтобы мембраны расположились на чашках одинаковым образом (это существенно упрощает последующий анализ автографов). Накладывать мембрану выгнув, последовательно от центра к краям.
п. 12.
Проколы делаются для того, чтобы потом сориентировать сигнал на автографе относительно чашки. Т.к. мембрана после гибридизации слегка меняет размер, для такой ориентации особое значение имеют проколы ближайшие к сигналу. Нанесение проколов равномерно по площади гарантирует, что для любой точки чашки ближайшие проколы окажутся не слишком далеко.
"Вертикальность проколов". Мембрана ложится на агар, а автограф будет приложен ко дну чашки. Чтобы соответствие было аккуратным, проколы должны быть вертикальными.
п. 13.
Если поступить наоборот и брать пинцетом сторону, которая дальше всего отстоит от бортика чашки, то мембрана зацепится за бортики своими краями и "скользнёт" по поверхности агара (это может привести к разрушению слоя верхнего агара).
п.25-29.
На вторичный скрининг лучше использовать нитроцеллюлозные мембраны - они дешевле. При этом так же можно пользоваться UV-пришивкой (хотя во многих руководствах утверждается, что нельзя).
Мы используем для вторичного скрининга тот же гибридизационный буфер с меткой, что был использован для первичного (предгибридизационный буфер – свежий, а "старый" гибридизационный надо перед внесением прогреть ~3' в кипящей бане; его можно даже сохранить для картирования фагов).
п. 28.
Контрольный высев (1/2x105 часть бляшки) проводиться только для определения титра фага. Если используются чашки с нижним агаром диаметром 150mm, то на одной чашке умещается ~40 "капель-титров" верхнего агара.