Недостаток классических методов - длительность окрашивания (несколько часов). А хочется побыстрее, и иногда даже нужно побыстрее. Этот рецепт работает за 5-30 мин. Желаю приятного окрашивания! Shurik
после SDS-PAGE гель отмывается 5' в воде или согласно стандартной процедуре;
перенести гель в Staining solution, в свежем растворе инкубировать при покачивании минут 5-10;
окрашивается 5-30', в крайнем случае 60' (при длительной инкубации придется долго отмывать гель);
промыть водой, а если передержали гель в красителе, то можно убыстрить процесс 7% уксусной кислотой;
Staining solution (хранить при NT в плотно закрытой посуде)
Coomassie G-250
0.05%
Трихлоруксусная кислота
2%
Этанол или метанол
20%
Кумасси растворяется в спирте, затем добавляется вода и медленно, при перемешивании, TCA stock solution (10-100% по желанию). Готовый продукт не содержит никаких нерастворившихся частиц. Используется многократно.
Комментарии
Общие
Похожий протокол присылала Инна Кригер. Раствор Инны основан на хлорной кислоте, подобный ему мы много лет использовали в нашей лабе. Также подобный продается Сигмой (#B8872 Brilliant Blue G-Perchloriс acid solution).
Мой протокол основан на TCA и схож с сигмовским #B4523 Brilliant Blue G-TCA solution (0.08% Brilliant Blue G in 12% TCA, pH has been adjusted with H2SO4 and KOH to remove insolubles), но еще содержит спирт и не нуждается в доводке рН.
Кроме того, Сигма продает коллоидальный раствор - #B2025 Brilliant Blue G-Colloidal Concentrate (0.1% G, 0.29M H3PO4, 16% sat. (NH4)2SO4. Pierse продает Gel Code Blue Stain reagent (sensitivity 8 ng) и BioRad - BioSafe Coomassie Stain (8-28 ng). Я сравнивал свой раствор с двумя последними и не нашел различий в окрашивании (кроме скорости окраски).
Вообще-то нужно указывать по какому белку проверялась чувствительность. Например, я прежде работал с запасными глобулинами семян, так окрашивание серебром не увеличивает чувствительности. Если работать с грубыми экстрактами, то некоторые бэнды окрашиваются лучше в кумасси. Ещё я сравнивал окрашивание альбуминовой фракции экстрактов семян по серебру (кит Bio-Rad) с моим раствором, так серебро было чувствительнее где-то в 2-5 раз всего-навсего.
По пунктам
п. 4.
При хранении в воде при комнатной температуре гель быстро зарастает, лучше ставить в холодильник.