Главная страница MolBiol.ru > Методы > Экспрессия > Hot-start Taq полимераза Rambler's Top100
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

Приготовление hot-start Taq полимеразы

 

    Экспрессия и очистка фермента

  1. приготовить Taq полимеразу, как описано в протоколе Очистка Taq полимеразы вплоть до посадки на колонку (п.42). В отличии от того протокола, полимераза должна сойти с колонки в буфере без детергента. Так что после предварительной промывки колонки Buf.C (50mM KCl, 0.5mM PMSF) (п.43) надо промыть её буфером с той же солью, но без детергента Buf.C w/o (50mM KCl, 0.5mM PMSF), а потом элюировать белок тоже бездетергентным буфером Buf.C w/o (400mM KCl, 0.5mM PMSF)
  2. лучше, если тут же и приступить к инактивации, но при желании можно разаликвотить фермент, заморозить аликвоты в жидком азоте и хранить при -70oC


  3. Приготовление химически-инактивированного фермента

  4. предварительно прогреть на 37oC нужный объём 1х буфера C без детергента (C w/o);
  5. добавить 37% формальдегид из расчета 20µl на 1ml, смешать;
  6. добавить Taq полимеразу (тоже предварительно прогретую) до концентрации 20u/µl;
  7. инкубировать 30' при 37oC;
  8. охладить раствор в ледяной бане, 2÷5';
  9. ЦФ 4krpm 3';
  10. перенести супернатант в пробирку с равным объёмом (NH4)2SO4, смешать;
  11. 10' ледяная баня;
  12. промыть осадок смесью {Buffer C w/o 1x & 2M (NH4)2SO4};
  13. аккуратно снять надосадочную жидкость;
  14. растворить осадок в {Buffer C w/o 1x & 50mM KCl} в объёме ~1/25 от объема раствора в п.3;
  15. ЦФ 14krpm 15';
  16. диализовать супернатант против Buffer D как описано в протоколе Очистка Taq полимеразы;
  17. хранить рабочие аликвоты при -20oC, основной сток — в аликвотах при -70oC
  18. единственное отличие PCR протоколов с использованием hot-start Taq: в самом начале должен присутствовать этап активации фермента (95oC, 10 мин.)


  19. Определение активности фермента и степени инактивации

  20. определение активности проводится почти так-же, как описано в протоколе "Определение активности полимеразы", единственное различие, перед элонгацией необходимо активизировать Taq полимеразу;
  21. температурный профиль "с активацией фермента": 95oC — 15 мин.
    37oC — 1 мин.
    72oC — 15 мин.
  22. температурный профиль "без активации фермента": 37oC — 16 мин.
    72oC — 15 мин.


    Комментарии

    Общие

  • Протокол написан по патенту Ivanov I., Loffert D., Kang J., Ribbe J. and Steinert K. (2001) Method for reversible modification of thermostable enzymes. United States Patent 6,183,998 с небольшими модификациями.
  • Мы предпочитаем пользоваться hot-start ферментом для всего, кроме самых простых применений. Разница просто потрясающая. В тесте на чувствительность фрагмент актинового гена надежно амплифицировался с человеческой геномной ДНК:
    1. hot-start Taq полимераза — с 10pg геномной ДНК;
    2. обычная Taq полимераза — с 10÷30ng геномной ДНК
    LDR-TaqMan SNP-анализ идет надежно только при использовании hot-start фермента. Когда мы посмотрели на форезе, что поднимается hot-start ферментом, а что — обычным, в одном случае были четкие полоски, в другом — сплошной шмер.
  • Типичный выход 1÷5% от исходной активности фермента. То есть, если взять исходно 1000u Taq, то обычно получается ~25u hot-start фермента.
  • Обычный уровень инактивации — ~5x103. То есть, активность на 72oC предварительно прогретого (95oC, 15 мин.) и непрогретого фермента (то же время на 37oC) различается в 5000 раз.
  • В нашем морозильнике пробирка с hot-start полимеразой пролежала год при -20oC без какого-либо изменения активности и степени инактивации.
  • Существует ещё один протокол приготовления hot-start полимеразы: Birch D., Laird W., Zoccoli M. (1996) Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme. United States Patent 5,773,258. Мы предпочитаем формальдегидную инактивацию по двум основным причинам:
    1. формальдегидная инактивация снимается в буферах с более широким спектром pH (подробнее — см. патент Ivanov I. et. al.)
    2. формальдегид легче выносит хранение, чем citraconic anhydride или cis-aconitic anhydride;
    3. citraconic anhydride и cis-aconitic anhydride приходится заново разводить при каждом применении;
    4. формальдегидная инактивация слабо зависит от буфера, в котором происходит реакция (одинаковые результаты для Hepes и боратного буфера), citraconic anhydride — нужно использовать боратный буфер), cis-aconitic anhydride нужно использовать Hepes
  • По пунктам

    п.4.

  • В наших руках только совсем уж древний формальдегид давал странные результаты. Формальдегид годичной давности работал нормально. Один раз пытались использовать "формальдегид, свежеприготовленный из параформальдегида, но получилось не лучше, чем для растворов.
  • Предварительный прогрев используется для того, чтобы результаты инактивации были стабильнее.
  • п.6.

  • Если хочется увеличить степень инактивации, можно либо увеличить концентрацию формальдегида, либо удлиннить время обработки. Но при этом также упадет "выход" фермента. В наших руках изменение концентрации формальдегида:
    • 1/4х: в 3 раза больше активность, коэфф. активации — 30
    • 1/2х: в 1.5 раза больше активность, коэфф. активации — 150
    • 1х: коэфф. активации — 5000
    • 2х: в 1.5 раза меньше активность, коэфф. активации — 20000
  • п.9.

  • Сульфат аммония не только переосаждает фермент, но и инактивирует остатки формальдегида.
  • п.17.

  • Мы как-то смотрели на динамику активации фермента в зависимости от времени на 95oC. Идея была, что два процесса — освобождение от связанного формальдегида и термическая инактивация белка должны дать некий оптимум для времени активации. Однако оказалось, что активность устойчиво растёт в течении полутора часов. Дальше мы не смотрели, так как для реальных ПЦР-реакций это не интересно.
  • Обычно мы используем следующий ПЦР буфер 10x: Tris-HCl pH 8, 100mM; KCl, 500mM; EDTA 0.1mM; Tween 20 0.5%

    Дополнения, комментарии, вопросы





       


Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · · Zbio-wiki

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler