приготовить Taq полимеразу, как описано в протоколе Очистка Taq полимеразы вплоть до посадки на колонку (п.42). В отличии от того протокола, полимераза должна сойти с колонки в буфере без детергента. Так что после предварительной промывки колонки Buf.C (50mM KCl, 0.5mM PMSF) (п.43) надо промыть её буфером с той же солью, но без детергента Buf.C w/o (50mM KCl, 0.5mM PMSF), а потом элюировать белок тоже бездетергентным буфером Buf.C w/o (400mM KCl, 0.5mM PMSF)
лучше, если тут же и приступить к инактивации, но при желании можно разаликвотить фермент, заморозить аликвоты в жидком азоте и хранить при -70oC
хранить рабочие аликвоты при -20oC, основной сток — в аликвотах при -70oC
единственное отличие PCR протоколов с использованием hot-start Taq: в самом начале должен присутствовать этап активации фермента (95oC, 10 мин.)
Определение активности фермента и степени инактивации
определение активности проводится почти так-же, как описано в протоколе "Определение активности полимеразы", единственное различие, перед элонгацией необходимо активизировать Taq полимеразу;
Протокол написан по патенту Ivanov I., Loffert D., Kang J., Ribbe J. and Steinert K. (2001) Method for reversible modification of thermostable enzymes. United States Patent 6,183,998 с небольшими модификациями.
Мы предпочитаем пользоваться hot-start ферментом для всего, кроме самых простых применений. Разница просто потрясающая. В тесте на чувствительность фрагмент актинового гена надежно амплифицировался с человеческой геномной ДНК:
hot-start Taq полимераза — с 10pg геномной ДНК;
обычная Taq полимераза — с 10÷30ng геномной ДНК
LDR-TaqMan SNP-анализ идет надежно только при использовании hot-start фермента. Когда мы посмотрели на форезе, что поднимается hot-start ферментом, а что — обычным, в одном случае были четкие полоски, в другом — сплошной шмер.
Типичный выход 1÷5% от исходной активности фермента. То есть, если взять исходно 1000u Taq, то обычно получается ~25u hot-start фермента.
Обычный уровень инактивации — ~5x103. То есть, активность на 72oC предварительно прогретого (95oC, 15 мин.) и непрогретого фермента (то же время на 37oC) различается в 5000 раз.
В нашем морозильнике пробирка с hot-start полимеразой пролежала год при -20oC без какого-либо изменения активности и степени инактивации.
Существует ещё один протокол приготовления hot-start полимеразы: Birch D., Laird W., Zoccoli M. (1996) Nucleic acid amplification using a reversibly inactivated thermostable enzyme. United States Patent 5,773,258. Мы предпочитаем формальдегидную инактивацию по двум основным причинам:
формальдегидная инактивация снимается в буферах с более широким спектром pH (подробнее — см. патент Ivanov I. et. al.)
формальдегид легче выносит хранение, чем citraconic anhydride или cis-aconitic anhydride;
citraconic anhydride и cis-aconitic anhydride приходится заново разводить при каждом применении;
формальдегидная инактивация слабо зависит от буфера, в котором происходит реакция (одинаковые результаты для Hepes и боратного буфера), citraconic anhydride — нужно использовать боратный буфер), cis-aconitic anhydride нужно использовать Hepes
По пунктам
п.4.
В наших руках только совсем уж древний формальдегид давал странные результаты. Формальдегид годичной давности работал нормально. Один раз пытались использовать "формальдегид, свежеприготовленный из параформальдегида, но получилось не лучше, чем для растворов.
Предварительный прогрев используется для того, чтобы результаты инактивации были стабильнее.
п.6.
Если хочется увеличить степень инактивации, можно либо увеличить концентрацию формальдегида, либо удлиннить время обработки. Но при этом также упадет "выход" фермента. В наших руках изменение концентрации формальдегида:
1/4х: в 3 раза больше активность, коэфф. активации — 30
1/2х: в 1.5 раза больше активность, коэфф. активации — 150
1х: коэфф. активации — 5000
2х: в 1.5 раза меньше активность, коэфф. активации — 20000
п.9.
Сульфат аммония не только переосаждает фермент, но и инактивирует остатки формальдегида.
п.17.
Мы как-то смотрели на динамику активации фермента в зависимости от времени на 95oC. Идея была, что два процесса — освобождение от связанного формальдегида и термическая инактивация белка должны дать некий оптимум для времени активации. Однако оказалось, что активность устойчиво растёт в течении полутора часов. Дальше мы не смотрели, так как для реальных ПЦР-реакций это не интересно.
Обычно мы используем следующий ПЦР буфер 10x: Tris-HCl pH 8, 100mM; KCl, 500mM; EDTA 0.1mM; Tween 20 0.5%