занять робот на те дни, когда Вы собираетесь проводить споттинг;
убедиться, что имеется достаточно мембран, Gel-blotting-papier GB004, 20хSSC, 10M NaOH, 30%EtOH, 96%EtOH;
нарезать Whatman 3MM по размеру мембран;
разморозить PCR-плашки выложив в один слой в холодной комнате. Центрифугировать их (800rpm), если это не было сделано заранее;
Подготовка QBOT к работе
протереть спиртом подставку для плашек, площадки для фильтров, ближнюю поверхность внутри робота (не протирать шину, по которой робот перемещается - она должна быть смазана маслом);
включить робот: сначала компьютер (переключатель за крышкой в правом углу), затем робот (зелёная кнопка слева посередине блока), и, наконец, воздух (ON, убедиться, что давление не осталось на нуле);
Program Manager => QBOT;
Genetix "Gridding/Picking Qbot" -> OK;
Initializing drivers, make sure, that power is on -> OK;
Make sure all doors are closed -> OK;
выбрать "Gridding";
провести контрольный споттинг с чернилами (1:100-500 разведение TG1 чернил в аналоге смеси для споттинга), визуально проконтролировать, что размер пятен постоянен, (если нет уверенности в том, как располагать фильтры на плашках - то по всем полям);
если картинка получилась однородной: отметить точное расположение полей spotting, сменить 30% EtOH в отмывочной ванне и переходить к реальному споттингу.
Перенос на влажные фильтры
если проводится споттинг на влажные мембраны: ABT-384 плашки вставить в металлические адаптеры.;
ввести программу;
установить ABT-384 плашки в stack (обрезанной стороной к себе);
"Gel-blotting-papier GB004, Schleicher&Schuel" смочить в 0.4M NaOH и уложить на подставку;
мембрану смочить в 0.4M NaOH и уложить на GB004 (без пузырьков);
прокатать сэндвич пипеткой, чтобы убрать лишнюю жидкость (чтобы пятна не слишком расплывались);
начать spotting;
робот предлагает провести вначале guide-dot spotting;
если требуется использовать два guide-dot нужно будет по окончании одной программы запустить следующую и остановить её после guide-dot spotting;
прижечь мембраны UV (Standart crosslink);
нейтрализовать в двух сменах нейтрализующего раствора (0.1M Tris Cl, pH7.4, 4x SSC);
Главное при работе с плашками - не давать им подсыхать: на комнатной температуре плашки могут лежать не завёрнутыми в SaranWrap не больше 1-2 часов, под ламинаром - не больше, чем несколько минут.
Чтобы иметь представление о необходимом для spotting времени: 42 плашки и 2 guide dot разносятся по 6 фильтрам (паттерн 4х4, 12 переносов в каждую точку) за ~14h. На "Amazon" для 10-кратного переноса одной плашки на 6х6 полей требуется ~27 минут.
Для guide-spotting мы использовали cDNA arabidopsis 1 µg/ml.
По пунктам
п. 4.
Все фокусы с "однослойным" раскладыванием плашек посвящены тому, чтобы с внутренней стороны крышки не образовывался конденсат, который способен стать жидким мостиком между ячейками плашки. Правило очень простое: конденсат образуется тогда, когда температура крышки становится меньше температуры плашки. Умеренные количества конденсата можно промакнуть фильтровалкой (для бактерий - стерильным куском Watman 3MM).
п. 7.
Меню "Gridding":
Spotting Routine
Name
(Save, Restore, New)
Configuration
Type of spotting Head
384 sprung
Spotting pattern
(name, кнопка просмотра)
Total number of filters:
(?)
No of stamps per spot:
(?)
Fields per filter:
(?)
Enable Duplicate Pattern:
(переключатель)
Enable Identical Fields:
(переключатель)
No of Identical Fields:
(?)
Startup settings
First Plate to Spot
1
First Field to Spot
1
First Pattern to Spot
1
First Filter to Spot
1
Sterilising Setup
No of cycles in Bath
8
Seconds in Dryer
10
Wait after Drying
10
Additional Options>
Bare Code Reading
(-)
Plate Stacker Enable
(+)
Нижнее меню
Diags
Diagnostic screen
Outputs
I/O monitor
Config
gridding configuration
Close
Run
старт программы.
п. 10.
Внимание!!!: перед установкой плашек с адаптерами в робот нужно обязательно проконтролировать, что все адаптеры установлены правильно. Сдвинутый на один ряд адаптер приводит к тому, что плашка не устанавливается роботом в держатель, она либо вылетает, либо начинает портить gadget (это как "повезёт"...)
Есть два альтернативных варианта проведения spotting:
* из PCR смеси на влажные (в 0.4M NaOH) мембраны,
* на сухие мембраны из PCR смеси к которой добавлен NaOH до 0.5M.
Оба способа имеют как преимущества, так и недостатки. При переносе на влажные фильтры:
пятна получаются заметно большего размера, чем при переносе на сухие (не рекомендуется плотности выше, чем 4х4),
при spotting большого количества плашек мембраны могут подсыхать, равномерность подсыхания на разных мембранах практически не контролируется;
При переносе на сухие фильтры:
требуется дополнительная операция - добавление к PCR-смеси NaOH,
говорят, что присутствие щелочи портит PCR-продукты (возможно, что это зависит от присутствия бетаина), поэтому принято после её добавления быстро (в течение ~недели отспотить все фильтры);
Мы считаем, что преимущества споттинга на сухие фильтры сильно перевешивают его недостатки.
п. 11.
Составление программы(qbot123):
тот порядок, в котором робот разносит PCR-смесь по мембранам выглядит довольно странно. Но он вполне глубокомысленен по сути: идея в том, чтобы сделать фильтры как можно более похожими друг на друга вне зависимости от того, что в ходе споттинга с отдельной иглой/ячейкой может что либо произойти (например: игла застряла в gadget или закончилась смесь в ячейке). При споттинге робот оперирует такими понятиями как "фильтр" и "поле". "Фильтр" - соответствует реальным 22х22 фильтрам, каждый "фильтр" разделён на "поля" (их может быть до 6). "Поле" -соответствует площади, накрываемой gadget. И "фильтры" и "поля" упорядочены.
Порядок фильтров:
4
5
6
1
2
3
Stack
Порядок полей: можно назначить произвольное количество полей от 1 до 6. При этом их порядок зависит от того, обозначены они идентичными или различными.
Количество идентичных полей.
0
1
2
3
4
5
6
1
2
2
2
1
1
1
2
3
1
3
1
2
3
1
2
2
3
4
2
4
2
4
2
4
1
3
1
3
1
3
1
2
3
2
3
4
2
4
1
5
4
1
5
3
1
5
2
6
3
2
6
3
4
2
6
6
4
5
4
2
6
4
1
5
4
1
5
3
1
5
3
1
2
3
1
5
Spotting происходит по следующей схеме:
1. забирается первая плашка;
2. однократный перенос (но обоих дубликатов, если "duplicates enable") по всем фильтрам на первое из идентичных полей;
3. то же - на второе из идентичных полей;
4. .......
5. то же - на последнее из идентичных полей;
6. повторить п.п.1-5 в общей сложности столько раз, сколько заказано переносов на отдельную точку;
7. плашка возвращается в Stack;
8. забирается следующая плашка;
9. для неё выполняются пункты 2-6, перенос начинается со следующего по счёту поля.
Небольшое пояснение: таким образом если, например все поля различны, то при 10-кратном spotting на 6 фильтров
первая в "Stack" плашка переносится: 1 поле фильтра 1; дубликат на 1 поле фильтра 1; 1 поле фильтра 2; дубликат на 1 поле фильтра 2;.........; 1 поле фильтра 6; дубликат на 1 поле фильтра 6;
всё повторяется ещё 9 раз;
плашка возвращается в Stack, вторая 384-плашка переноситься:2 поле фильтра 1; дубликат на 2 поле фильтра 1; 2 поле фильтра 2; дубликат на 2 поле фильтра 2;........; 2 поле фильтра 6; дубликат на 2 поле фильтра 6;
всё повторяется ещё 9 раз;
и так далее...
Если не хочется, чтобы 384-плашки оказались разбросанными по фильтру в довольно экзотическом порядка придётся нарисовать для себя схему Spotting, и руководствуясь ей переупорядочить плашки в Stack так, чтобы на фильтре они расположились в "нужном" порядке (на самом деле порядок переноса совершенно не важен, главное, чтобы он был известен, всё равно обсчёт изображения будет проводится на компьютере). Ниже приведён пример spotting 42 плашек с двумя guide dots. Первой считается правая колонна.
Поле 2
Поле 6
Поле 3
31
33
34
G2
17
19
20
G2
3
5
6
G2
30
35
31
32
16
21
17
18
2
7
3
4
34
32
G1
33
20
18
G1
19
6
4
G1
5
30
29
35
29
16
15
21
15
2
1
7
1
38
40
41
G2
24
26
27
G2
10
12
13
G2
37
42
38
39
23
28
24
25
9
14
10
11
41
39
G1
40
27
25
G1
26
13
11
G1
12
37
36
42
36
23
22
28
22
9
8
14
8
Поле 4
Поле 1
Поле 5
Расположение плашек в стеке:
Номер колонны:
1
2
3
4
5
22
37
25
40
28
29
9
32
12
35
1
16
4
19
7
36
24
39
27
42
8
31
11
34
14
15
3
18
6
21
23
38
26
41
30
10
33
13
2
17
5
20
"Cтандартный" 3х3 паттерн:
3
2
4
4
g
3
1
2
1
"Cтандартный" 4х4 паттерн:
3
5
6
g2
2
7
3
4
6
4
g1
5
2
1
7
1
п.15.
Для того, чтобы уложить 6 фильтров требуется ~800ml 0.5M NaOH.
MolBiol.ru >
Методы >
Макро-методы > Spotting (QBOT)
Zbio-wiki
Дополнить