приготовить 10 пробирок "N1"-"N10" (из расчета ~0.2µg плазмидной DNA на 20µl в буфере для обработки DNase I);
разаликвотить:
N1=40µl,
N2=20µl,
..............
N9=20µl,
N10=20µl;
развести DNase I до концентрации 100µu/µl в буфере для разведения;
добавить к "N1" 1µl разведённого фермента, пипетировать ~4 раза. 1/2 материала перенести в следующую пробирку и смешать, следующий шаг - новым типом и т.д.
в 10ю пробирку ничего переносить не надо, она будет служить контролем "без DNase" (9 пробирок обрабатываются за ~10');
DNase I расщепление 37оС, 1h;
разогнать реакции на форезе и выбрать концентрацию DNase I, которая даёт наибольшее количество линейной DNA;
Препаративное расщепление
Препаративное расщепление проводится в одной пробирке и отличается от аналитического только заполнением концов с помощь T4 DNA полимеразы.
Ссылка: Nabirochkina EN, Georgieva SG, Krasnov AN, Soldatov AV. Rapid construction of sequencing templates by random insertion of antibiotic resistance genes. Biotechniques. 2002 Feb;32(2):300, 302-4.
.
Метод больше всего напоминает in vitro инсерционный мутагенез в системах на основе транспозона Tn5 (EF:TN, Invitrogen), Tn7 (GPC, New England Biolabs) или Mu (TGS, Finnzymes, Espoo, Finland). Главный недостаток транспозонных методов - дорогие киты, достоинство - повтор нескольких нуклеотидов в точке инсерции, который позволяет однозначно сшивать последовательности, сиквенированные в противоположные стороны.
Так как двухцепочечный разрыв DNase I не всегда даёт тупые концы, затупление T4 полимеразой приводит к появлению разрывов разного размера. Для сиквенированных нами фрагментов средний размер разрыва - 20bp.
Схема получения инсерционных мутатнов:
а) DNase I вносит двухцепочечные разрывы;
б) T4 DNA полимераза достраивает разрывы до тупых концов;
в) по тупым концам встраивается ген устойчивости к антибиотику;
г) плазмиды со вставкой отбираются на чашке с антибиотиком.
Как показано на рисунке, часть клонов содержат инсерцию за пределами сиквенируемого участка. Можно оценить соотношение клонов с неподходящим и подходящим местами инсерции как отношение длины вектора (без учёта длины гена устойчивости к антибиотику и участка начала репликации) к длине сиквенируемого фрагмента. Для типичного 3т.п.н. вектора с 4т.п.н. вставкой это отношение: 1.26т.п.н./4т.п.н. = 0.315. Для 7т.п.н. вставки - 0.18.
По пунктам
п. 1-6.
Для инсерционного мутагенеза одновременно нескольких плазмид можно проводить аналитическое расщепление только одной из них. После этого, достаточно брать приблизительно то же количество других плазмид, чтобы получить оптимальное расщепление.
п. 1.
Расщепление DNase I проводится в буфере, содержащем ионы Mn2+, чтобы вызвать преимущественное образование не одноцепочечных, а двухцепочечных разрывов.
п. 5.
Концентрация DNase I подбирается так, чтобы для оптимального расщепления требовался 1 час. Такое долгое время выбрано, чтобы (i) уменьшить разброс во времени реакции для препаративных экспериментов и (ii) провести затупление концов фрагментов за последние 5' с помощью быстро работающей ДНК полимеразы T4 без замены буфера и очистки ДНК.
Анализ при подборе оптимальной концентрации DNase I несложен, так как отслеживается переход одной четкой полосы (суперскрученной ДНК) в другую чёткую (линейная ДНК).
п. 5.
10х буфер для T4 ДНК полимеразы: {NaCl 500mM, TrisCl (pH7.9) 100mM, MgCl2 100mM, DTT 10mM}.
п. 10.
Ген устойчивости к канамицину был проклонирован в векторе pBluescript SK II(-)/ EcoR V после ПЦР амплификации с использованием праймеров: 5' ATgAgCTgATATCACAAATTC и 5' CTCgATATCTTCCTTTTTCAATTC (сайты узнавания EcoR V, введённые в праймеры, выделены красным цветом) из плазмиды, несущей ген устойчивости к антибиотику (pCR TOPO II; Invitrogen).
Для инсерционного мутагенеза KanR фрагмент (1.15тпн ) был вырезан по фланкирующим рестриктазам EcoR V и приготовлен при концентрации ~0.5µg/µl.
п. 11.
Количество отбираемых клонов зависит от размера сиквенируемого фрагмента и длины участка, который прочитывается с одного праймера. На анализ стоит взять 2.5 - 3 кратный избыток клонов, по сравнению с минимально необходимым количеством. Колонии с чашки переносятся в 20 - 50µl среды с антибиотиками (либо переносится вся колония и хорошо ресуспензируется; тогда можно сразу работать дальше, либо необходимо подрастить бактерии на 37oC) в течение 6 - 16h.
п. 12.
Использовались праймеры, соответствующие концам KmR гена:
(#1k) 5' CgTTTCTgCggACTggCTT
(#2k) 5' TCCCgATTCgCAgCgCAT
и полилинкеру плазмиды:
(#1v) M13(-20) Forward 5' TgTAAAACgACggCCAgTgAATTgTAATAC
(#2v) M13 Reverse 5' TTggCgTAATCATggTCATAgCTgTTTCC
Бетаин позволяет наносить смесь на форез без добавления буфера для внесения. Крезоловый красный служит подвижным красителем.
Ориентация встроившегося KmR гена заранее неизвестна. Для того, чтобы амплифицировать те участки, на которые он разбивает сиквенируемый фрагмент, приходится ставить одновременно четыре ПЦР реакции на каждой колонии.
ПЦР идёт лишь в половине случаев. Чтобы не загромождать форез пустыми реакциями, в состав ПЦР буфера включён бромистый этидий. Под ультрафиолетом светятся только те пробирки, где в ходе реакции образовалась двухцепочечная DNA.
Мы не пробовали, но по-видимому, можно проводить лишь пару ПЦР реакций для каждого клона, используя в ПЦР смеси по три праймера: один векторный и оба из гена устойчивости к антибиотику.
384-луночная ПЦР плашка при освещении ультрафиолетом.
Матрицы наносились в одинаковом порядке в четыре зоны (они разделены на фотографии белыми линиями, пустые ячейки перечёркнуты). Для каждой зоны использовался свой комплект праймеров (указаны над плашкой). Как и следует ожидать ПЦР для каждого клона идёт лишь с двумя из четырёх сочетаний праймеров.
п. 13.
Определить точный размер вставок с одного прогона сложно, особенно, если анализируется множество клонов. Мы проводим анализ следующим образом:
на общем форезе определяем приблизительный размер фрагментов;
отбираем несколько избыточное количество (~ в 1.5 раза) клонов с различным положением инсерции;
проводим проверочный форез, нанося клоны в порядке, соответствующем предполагаемому положению места вставки. При таком нанесении сравниваются размеры фрагментов, идущих по соседним дорожкам, поэтому ошибка минимальна.
Убывание длины одного фрагмента при возрастании длины другого приводит к появлению на форезе характерной крестообразной (или бабочкообразной - кому как больше нравится) фигуры.
Каждой инсерции соответствуют два ПЦР фрагмента. Это позволяет весьма точно проводить анализ положения места инсерции. Проблемы с точностью возникают при увеличении длины анализируемой ДНК. Но, (i) при увеличении длины одного ПЦР фрагмента длина второго уменьшается (поэтому места инсерции, расположенные на расстояниях до ~3тпн от какого либо из концов, локализуются аккуратно) и (ii) когда место инсерции оказывается далеко от обоих концов фрагмента, можно сравнивать ПЦР продукты друг с другом (это увеличивает допустимую длину ещё на 1 - 2тпн).
п. 14.
Сиквенировать можно как с ПЦР-праймеров (#1k и #2k), так и со внутренних сиквенирующих праймеров: (#1k_s) 5' CTACgTgTTCCggTTCCTT и (#2k_s) 5' CATCgCCTTCTATCgCCTTC. Праймеры располагаются на следующих расстояниях от края инсерции: (#1k): 49н.т.; (#2k): 50н.т.; (#1k_s): 29п.н.; (#2k_s): 33н.т.
MolBiol.ru >
Методы >
Nest. deletions > Инсерцией KanR гена
Zbio-wiki
Дополнить
пипетировать ~4 раза. 1/2 материала перенести в следующую пробирку и смешать, следующий шаг - новым типом и т.д.