Главная страница MolBiol.ru > Методы > ДНК из геля > С помощью glass milk Rambler's Top100
[Войти] [Регистрация]
ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · Выделите орфографическую ошибку мышью Рё нажмите Ctrl+Enter. Сделаем язык чище! · Zbio-wiki
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика      

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью glass milk

Очистка DNA из агарозного геля
Приготовление glass milk
Растворы
STE/EtOH
NaI
EB
Комментарии
Общие
По пунктам
 Дополнить
Метод можно использовать для выделения/очистки как двухцепочечной, так и одноцепочечной DNA.

    Очистка DNA из агарозного геля

  1. вырезать нужную полоску под длинноволновым UV (360 nm);
  2. взвесить;
  3. + необходимый объём "NaI";
  4. 50oС, 10' или пока вся агароза не расплавится (время от времени помешивая);
  5. проверить, что цвет раствора желтый (если красный - добавить немного (1-5µl) 3M NaOAc, pH~5);
  6. + объём изопропанола, равный объёму геля;
  7. + необходимое количество 50% SiO2
  8. мягко смешивать ~5' NT;
  9. ЦФ 5'', сбросить супернатант;
  10. не обязательно
    11.

    если требования к чистоте фрагмента очень высокие - сполоснуть 100-200µl "NaI";

  11. добавить 0.5ml STE/EtOH, либо пипетировать, либо вортекс, ЦФ 5'', сбросить супернатант;
  12. повторить п.11 ещё 2 раза;
  13. ЦФ 5'', тщательно убрать остатки STE/EtOH;
  14. не обязательно
    15.

    если DNA чистится для электропорации, дополнительно промыть 1 раз 80% EtOH.

  15. + EB в объеме, не меньшем, чем объем glass milk;
  16. вортекс 5-20'';
  17. 20о-50oС, 1-5';
  18. ЦФ 20'';
  19. перенести супернатант в новую пробирку;
  20. можно элюировать остатки DNA с glass milk ещё раз.


    21. Приготовление glass milk.

  21. в 200ml стакане суспензировать с помощью магнитной мешалки 10g Silicon dioxide в ~100ml кислоты (азотной или соляной), 2h-ON;
  22. 2x промыть ~100ml смеси (метанол:соляная кислота=1:1);
  23. в 200ml стакане суспензировать с помощью магнитной мешалки в ~150ml H2O;
  24. дать осесть под действием силы тяжести (~15'), сбросить надосадочную жидкость;
  25. повторить (п. 23, 24) 4 раза;
  26. дать осесть под действием силы тяжести 2', забрать надосадочную жидкость;
  27. осадить в 50ml пробирке (ЦФ 5krpm, 3');
  28. добавить объём H2O равный объёму SiO2, суспензировать.
  29. хранить рабочий сток (~1ml) при NT, основной - при -20oС.


MolBiol.ru: http://molbiol.ru
e-mail: redactor@molbiol.ru
просмотров: 24231

    Растворы

    STE/EtOH

    (хранить при 4oС в плотно закрытой ёмкости):

    Конц.Сток50.0ml
    Tris HCl, pH7.010mM1.0M0.5ml
    EDTA1mM0.5M0.1ml
    NaCl100mM5.0M1.0ml
    EtOH~75%~96%40.0ml
    H2O mQ8.4ml

    NaI

    (хранить при 4oС в защищенной от света ёмкости):

    Конц.Сток10ml50ml
    NaI6.6M149.9g/M9.9g49.5g
    Na2SO316mM126.04g/M0.02g0.1g
    Cresol red (Na)0.25mM10mM0.25ml1.25ml
    H2O mQ7.12ml35.6ml

    EB

    elution buffer: хранить при 4oС

    Tris HCl, 10mM, pH8.5.



    Комментарии

    Общие

  • Очистка на glass milk, как и на любых других silica-particles приводит к частичной денатурации DNA. Это особенно опасно в случае гетерогенной DNA. Если предполагается использование очищенного материала в процедурах, требующих, чтобы DNA была двухцепочечной (например, расщепление рестриктазами), то лучше glass milk не использовать.
  • Метод позволяет выделять фрагменты ~0.2-15kbp с эффективностью не менее 80%. Его можно использовать и для очистки DNA в водных растворах (между ферментативными реакциями, после PCR и т.п.). В этом случае процедура начинается с п.3.
  • Для фореза нужно использовать TAE буфер /прислано дополнение, что можно вести форез и в TBE, но тогда к NaI нужно добавить маннитол до концентрации 0.1М, чтобы гель растворился/.
  • Принцип метода: DNA связывается с silica-particles в высокой соли. Примеси отмываются. DNA снимается Tris-буфером или водой.
  • Адсорбция зависит от pH, резко уменьшаясь при pH>7.5. Для визуального контроля в NaI вводится Cresol red: при pH<7.5 он желтый, а при pH>7.5 - красный.
  • Эффективность элюции зависит от элюирующего буфера: концентрации соли должна быть минимальной, а pH должен быть >8.0.


    • По пунктам

    п. 1.

  • Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:
    • 3.2kb~ 4 раза
    4.8kb~ 30 раз
    8.2kb~ 500 раз
  • Непроверенная информация Можно увидеть DNA и при обычном свете, если использовать для окраски Cristal Violet (стоковый раствор 2mg/ml). В агарозный гель добавить до 0.80-1.6µg/ml (40-80µl на 100 ml); уходит из геля к отрицательному полюсу. Образец наносить, добавив 6х Load. Buffer:

    • Glycerol => 30%
    EDTA => 20mM
    Cristal Violet => 100µg/ml.

    п. 2.

  • Взвесить - все равно, что измерить объем, только технически проще.
  • Вырезанную полоску агарозы можно хранить несколько дней при -20oС

    • п. 3.

  • Объём NaI должен быть таким, чтобы:
    1. агароза составляла<0.25% от финального объема,
    2. но не менее 3хVгеля.(или объёмов ферментативной реакции).

    например: для 0.75% геля - 3xVгеля; 1.0% - 3xVгеля; 1.5% - 5xVгеля.

    п. 4.

  • Желтый цвет NaI позволяет лучше видеть не расплавившуюся агарозу. Агароза плавится за ~5' .

    • п. 5.

  • Адсорбция DNA на частицы SiO2 зависит от pH, резко уменьшаясь при pH>7.5. Желтый цвет "NaI" соответствует pH<7.5.

    • п. 6.

  • Изопропанол улучшает адсорбцию DNA. Это особенно важно при выделении небольших (<0.7 kbp) фрагментов.
  • Непроверенная информация Для малых (<500bp) фрагментов лучше дополнительно добавить 1/20V 1% уксусной кислоты. Это приводит к понижению рН до ~ 6.5.
  • Непроверенная информация Повышение температуры до 55oС улучшает связывание.

    • п. 7.

  • Ёмкость SiO2: >2µg 3kbp линейной dsDNA на 1µl 50% суспензии, но если использовать <1µl/µg, частицы SiO2 начинают агрегировать.
  • С объемами 50% суспензии SiO2 меньшими, чем 0.5µl, работать неудобно, видимо, разумный компромисс - 2-3µl, если количество DNA меньше, чем 1µg. Если больше, то дополнительно по 2µl на каждый дополнительный микрограмм DNA.
  • Еще одно соображение, чтобы в растворе была приемлемая концентрация silica particles: для 0.5ml - минимум 8µl, для 1.0ml - минимум 16µl.

    • п. 9-13.

  • Отмывка. Смываются: праймеры, соли, белки, агароза, EtBr, масло, DMSO, детергенты.

    • п. 11.

  • В STE/EtOH SiO2 частицы ресуспензируются с трудом, вполне вероятно, что вместо Vortex придется применять пипетирование.

    • п. 13.

  • Если это необходимо, можно убрать остатки EtOH, подсушив glass milk (5-10' на столе или 2-5' под вакуумом).

    • п. 14-18.

  • Элюция DNA. DNA можно снимать с частиц в любом низкосолевом буфере, но важно, чтобы pH был в районе 7.0-8.5.
  • Прогрев особенно важен, если DNA длинная (>5kbp).
  • Если стараться забрать всю водную фазу, неизбежно захватывается некоторое количество glass milk. Для большинства применений это не опасно, т.к. SiO2-частицы слабо связывают DNA в растворах с менее, чем 3М солью. Если все же желательно избавиться от SiO2:

    • * перед использованием ЦФ полученный раствор, а аликвоту отбирать с самого верха;
    * ЦФ через ЦФ-фильтр.

  • Остаточное загрязнение NaI можно проконтролировать по UV поглощению. NaI имеет 2 максимума: один в районе 195nm, второй- 226.5nm => CNaI[µM] =74xA226.

    • п. 20.

  • Вторая элюция может дать дополнительно 10-20% DNA.

    • п. 21.

  • SiO2- Sigma, #S-5631

    • п. 22.

  • Отмывка кислотой частиц SiO2от грязи.

    • п. 23-25.

  • Отмывка от кислоты.
  • Отмывка от слишком мелких частиц SiO2.

    • п. 26.

  • Отмывка от слишком крупных частиц SiO2.

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/


-- как прислать био-картинку --

    Дополнения, комментарии, вопросы

    Люди знающие! Здесь недостаёт того, что знаете вы, но не знал или забыл автор. Этой страницей пользуются ваши коллеги. Пожалуйста, поделитесь с ними опытом. Пригодится всё, что поможет в работе.

    Dimpler /15.03.2006 15:44/
    Использовал готовый набор Fermentas. Каталожный номер K#0513. Работает очень плохо(фрагменты были ~700bp). Предпочиатю выделять ДНК из геля методом замораживания-размораживания в 0,5 мл эппендорфе с последующим протыканием дырочки в дне и центрифугированием. Если агароза мешает в дальнейшей работе, применяю переосаждение спиртом (EtOH и iProOH выходы дают примерно одинаковые).



    Гость /26.03.2008 22:43/
    PCR fragment purification with Glass Microfiber filter GF/A, Watman, Cat No 1820 037

    1. Run 1.3 % agarose gel with PCR fragment and DNA lader marker.

    2. Cut piece of glass filter and cover it with elution membrane from one side. They both should be the same size. I user “Spectarapor membrane tubing, M.W. cutoff 12 000 – 14 000 Dalton).

    3. Make a hole in the agarose gel just in front of your PCR fragment and insert glass filter/ elution membrane in the hole. Glass filter face PCR fragment side.

    4. TAE buffer should not over cover the gel. Pour out extra TAE buffer. Dry gel with paper towel.

    5. Run gel for 5 more min at 108 V (your DNA from PCR fragment will be on your glass filter).

    6. Place filter into 500ml tube. Make a cut in the bottom of the tube with a needle. Place this tube into 1.5 ml Epinforf tube. Centrifuge for 8 min 13 000 rpm.

    7. Precipitate with 0.7 volume of iso-propanol. Centrifuge 15 min 13 000 rpm.

    8. Wash with cold 70% ethanol. Let it dry. Dissolve in 20ml TE.

    Gel: _ _ _


    _ PCR fragment
    ------- glass filter
    ------- elution membrane



    Storage of elution membrane.

    Cut the elution membrane into 5 cm pieces. Cut off the edges of membrane. Boil for 30 min in H2O. Replace H2O to 1mM EDTA. Boil for 1 min. Store at 40 C up to 6 months.



    Miss Marple /25.04.2008 12:29/
    При использовании[Qiaex II] кита в нашей группе получается стабильно низкий выход продукта. Для коротких 1кб продуктов 40-60 процентов, для длинных >4кб 8-12 процентов.
    Поиграли с временем для растворения агарозы, связвания и элюции - помогает, но незначительно. Чешем в затылке.



    Pythonoid /29.06.2010 15:46/
    У меня силика сильно слипается после ц/ф. Даже пипетируется с трудом.

    В чем может быть проблема?
    Выделяю геномную ДНК.



    guest: ммм /29.06.2010 16:41/
    --У меня силика сильно слипается
    У вас перегрузка по ДНК.
    Силки - мало, ДНК- много



    -Ъ- /29.06.2010 20:24/
    (guest: ммм @ 29.06.2010 17:41)
    Ссылка на исходное сообщение  --У меня силика сильно слипается
    У вас перегрузка по ДНК.
    Силки - мало, ДНК- много

    ммм прав. Возможно, еще силика очень мелкая. Каким китом пользуютесь?



    Pythonoid /30.06.2010 10:14/
    (-Ъ- @ 29.06.2010 21:24)
    Ссылка на исходное сообщение  ммм прав. Возможно, еще силика очень мелкая. Каким китом пользуютесь?


    силика - сигмовская.
    буферы - классические.

    А Вы не в курсе как фракция частиц (1-10 мкм) влияет?



    guest: ммм /30.06.2010 14:01/
    чем мельче тем вязче.



    -Ъ- /30.06.2010 14:43/
    ммм, частично прав - есть силики мельче микрона, но плохо сорбирующие ДНК.
    У Сигмы-Олдрджа несколько десятков силик(гелей) и ей подобных аналогов. Синтетических и природных, волокнистых и сферических и т д..
    Говорите, буфера классические? confused.gif



    Pythonoid /01.07.2010 09:04/
    (-Ъ- @ 30.06.2010 15:43)
    Ссылка на исходное сообщение  ммм, частично прав - есть силики мельче микрона, но плохо сорбирующие ДНК.
    У Сигмы-Олдрджа несколько десятков силик(гелей) и ей подобных аналогов. Синтетических и природных, волокнистых и сферических и т д..
    Говорите, буфера классические? confused.gif


    Ну енто гуанидинистые) а не '90'



    -Ъ- /01.07.2010 11:11/
    (Pythonoid @ 29.06.2010 16:46)
    Ссылка на исходное сообщение  У меня силика сильно слипается после ц/ф. Даже пипетируется с трудом.

    В чем может быть проблема?
    Выделяю геномную ДНК.

    Можно попробовать уменшить скорость ЦФ до 2 тыс/мин, но увеличить время ЦФ до 1 мин. Пипетирование отменяется - только вортексирование.
    С силикой Sigma S-5631 это обычная история ... frown.gif



    Pythonoid /01.07.2010 12:47/
    (-Ъ- @ 01.07.2010 12:11)
    Ссылка на исходное сообщение  Можно попробовать уменшить скорость ЦФ до 2 тыс/мин, но увеличить время ЦФ до 1 мин. Пипетирование отменяется - только вортексирование.
    С силикой Sigma S-5631 это обычная история ... frown.gif


    А на что лучше заменить ее? На celite?



    guest: ммм /01.07.2010 18:24/
    -На celite?
    Это почти песок, очень грубая фракция не нада на нее заменять.
    Подходит селикагель от 10 до 20-50 микрон.



    RJ Dio /02.07.2010 14:06/
    пардон, конечно, а на кой молочко всех мастей, если есть колонки? Давненько не пил молока (вообще, никто из млеков не потребляет в природе молока во взрослом состоянии), вспоминаю как страшный сон. колонки форева



    -Ъ- /02.07.2010 17:36/
    (RJ Dio @ 02.07.2010 15:06)
    Ссылка на исходное сообщение  пардон, конечно, а на кой молочко всех мастей, если есть колонки? Давненько не пил молока (вообще, никто из млеков не потребляет в природе молока во взрослом состоянии), вспоминаю как страшный сон. колонки форева

    С молоком вам не повезло в детстве. smile.gif По теории это одно и то же - что молоко, что колонки, что шарики магнитные, покрытие силикой. Как-нибудь подкину, всех трех видов киты, для испытания-сравнения всех трех видов, если не против, конечно.



    -Ъ- /02.07.2010 17:43/
    ... ну что за жизнь все без молока да без молока...



    -Ъ- /03.07.2010 22:42/
    А MN не проверял? рекомендую, для полного счастья. wink.gif



    anybody /18.07.2010 09:59/
    А что это за штуковина такая?

    www.diamond-dna.ru

    кто-нибудь пробовал выделение днк ? это что челекс русский чтоли или что-то еще



    -Ъ- /18.07.2010 18:05/
    (anybody @ 18.07.2010 10:59)
    Ссылка на исходное сообщение  А что это за штуковина такая?

    www.diamond-dna.ru

    кто-нибудь пробовал выделение днк ? это что челекс русский  чтоли или что-то еще

    Не разобрался - сайт такой смешной. smile.gif Крутая оборонная разработка. umnik.gif
    Похвально то, что пробники дают. Так что попробуйте и нам расскажете.



    guest: ммм /18.07.2010 20:09/
    --2. Адсорбция примесей, ингибирующих ПЦР с помощью сорбента (ДНК остается в растворе). Частицы сорбента имеют нанометровые размеры и не взаимодействуют с ДНК, что предотвращает ее механическую и химическую деградацию.

    Судя по названию и проскакивающему лет 6-7 назад на форуме вопросу про нано алмазы и ДНК E.coli. Наночастицы это наноалмаз, получаемый взрывотехническим способом.

    --3. Дополнительная очистка раствора осаждением белков (ДНК остается в растворе). Происходит дополнительная очистка ДНК от белков, полисахаридов и компонентов лизис-буфера.

    Странно, но возможно ПЭГ.

    --4. Осаждение и отмывка ДНК. Происходит селективное осаждение молекул ДНК высокоэффективным осадителем. Осаждающий буфер абсолютно нетоксичен и инертен; в отличие от спиртов, используемых для осаждения ДНК, не ингибирует ПЦР.

    Скорее всего высокая соль, возможно ацетат магния или кальция



    metrim /04.12.2016 19:27/
    Можно ли заменить в данной методике NaI на KI ?



    MMM /04.12.2016 20:28/
    можно



    genseq /04.12.2016 21:21/
    А разработчики случайно не из Пущино?



    -Ъ- /05.12.2016 09:48/
    (metrim @ 04.12.2016 20:27)
    Ссылка на исходное сообщение  Можно ли заменить в данной методике NaI на KI ?

    Нельзя. МММ - теоретик. frown.gif



    -Ъ- /05.12.2016 09:50/
    (metrim @ 04.12.2016 20:27)
    Ссылка на исходное сообщение  Можно ли заменить в данной методике NaI на KI ?

    Кстати, о какой методике речь? Много воды утекло за 6 лет.
    Агароза в КСI не плавится, даже при нагревании. Но самое главное - ДНК не липнет к сорбенту (силике) при высокой конц-ции КСI. Проверено собственноручно более 20 лет назад.



    genseq /05.12.2016 11:03/
    МММ - правильный теоретик. Речь шла о замене NaI на KI, а не на KCl.



    -Ъ- /05.12.2016 11:25/
    (genseq @ 05.12.2016 12:03)
    Ссылка на исходное сообщение  МММ - правильный теоретик. Речь шла о замене NaI на KI, а не на KCl.

    Ах да...KI yes.gif ашибился redface.gif ... пардон.
    Прав был мой друг - в понедельник надо выходить на работу после обеда. yes.gif beer.gif



    metrim /05.12.2016 11:40/
    (-Ъ- @ 05.12.2016 10:50)
    Ссылка на исходное сообщение  Кстати, о какой методике речь? Много воды утекло за 6 лет.
    Ну вот собственно о методике по выделению ДНК из форезного геля , той что в разделе Методы и к которой дданная ветка - "коменты"

    На хлорид калия я ничего менять и не собирался beer.gif

    Ну так иодид натрия на калий заменить без эффекта на работоспособность в буфере длф плавления можно?
    Почему "если нет разницы" везде в методиках я вижу тока иодид натрия?



    MMM /05.12.2016 12:08/
    Я не сравнивал но KI может быть меньше растворимость и им просто не достичь нуной консентрасии(если не ошибаюсь 6,6М). Но по секрету скажу, что скажем калия роданид уже в 3М концентрации скорее всего растворит агарозку.



    -Ъ- /05.12.2016 13:55/
    Иодиды натрия и калия не удобны в работе. Высокомолярные растворы даже а темной посуде начинают желтеть (появление молекулярного иода). Приходилось добавлять к раствору кристаллики тиосульфата чтобы обесцветить. Потом плюнул и заменил его на гуанидина тиоцианат.
    Протоколы на эту тему висят в инете, а самого Bio101 страницу не нашел. Видимо Кайджин сожрал с патрохами.

    http://kirschner.med.harvard.edu/files/pro..._geneclean2.pdf ( http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/MPBIO_geneclean2.pdf )
    http://www.labnet.fi/doc/nucleic_acid_purification.pdf ( http://www.labnet.fi/doc/nucleic_acid_purification.pdf )



    ksm /07.12.2016 16:18/
    а я, кстати, выделял с желтым NaI. особенных проблем не было...



    R.J.Dio /11.12.2016 10:02/
    (genseq @ 04.12.2016 22:21)
    Ссылка на исходное сообщение  А разработчики случайно не из Пущино?

    я бы не удивился. ТОгда по определению работать не должно



    watchesbiz /23.11.2021 15:52/
    https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1 ( https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1 )
    https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK ( https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshutuk/Hints-to-Help-You-Pick-the-Best-Replica-Watches-UK )
    https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505 ( https://www.tuugo.us/Companies/best-replica-watches/0310006695505 )
    https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/ ( https://topsitenet.com/article/988178-hints-on-choice-of-a-high-quality-employed-ladies-replica-rolex-watch/ )
    http://simp.ly/p/nxGlWb ( http://simp.ly/p/nxGlWb )
    https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22 ( https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-High-Quality-Employed-Ladies-Replica-Rolex-Watch-02-22 )
    https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html ( https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html )
    https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a ( https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a )
    https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch ( https://zenwriting.net/replicawatches24/hints-on-choice-of-a-high-quality-employed-ladies-replica-rolex-watch )
    https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en ( https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en )
    http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/ ( http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/ )
    https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch ( https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_choice_of_a_high_quality_employed_ladies_replica_rolex_watch )
    https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom ( https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom )
    https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/ ( https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/ )
    https://en.gravatar.com/allreplicawatches24 ( https://en.gravatar.com/allreplicawatches24 )
    https://8tracks.com/replicawatchesuk ( https://8tracks.com/replicawatchesuk )



    pullbase /07.02.2025 13:39/
    The novel first appeared on linexbet ( https://linexbet.app/ ) 13 March 1939, but sold barely 200 copies in the LINE X BET ( https://linexbet.app/line-x-bet-%e0%b9%80%e0%b9%80%e0%b8%9e%e0%b8%a5%e0%b8%95%e0%b8%9f%e0%b8%ad%e0%b8%a3%e0%b9%8c%e0%b8%a1%e0%b8%84%e0%b8%b2%e0%b8%aa%e0%b8%b4%e0%b9%82%e0%b8%99%e0%b8%ad%e0%b8%ad%e0%b8%99%e0%b9%84%e0%b8%a5/ ) first few months of publication. เว็บสล็อตออนไลน์ ( https://linexbet.app/%e0%b9%80%e0%b8%a7%e0%b9%87%e0%b8%9a%e0%b8%aa%e0%b8%a5%e0%b9%87%e0%b8%ad%e0%b8%95%e0%b8%ad%e0%b8%ad%e0%b8%99%e0%b9%84%e0%b8%a5%e0%b8%99%e0%b9%8c/ ) In 1940, Paternoster Row, ฝากถอนออโต้ ไม่มีขั้นต่ำ ( https://linexbet.app/%E0%B8%9D%E0%B8%B2%E0%B8%81%E0%B8%96%E0%B8%AD%E0%B8%99%E0%B8%AD%E0%B8%AD%E0%B9%82%E0%B8%95%E0%B9%89-%E0%B9%84%E0%B8%A1%E0%B9%88%E0%B8%A1%E0%B8%B5%E0%B8%82%E0%B8%B1%E0%B9%89%E0%B8%99%E0%B8%95%E0%B9%88/ ) the London home of ทางเข้าสู่ระบบ LINE X BET ( https://linexbet.app/%e0%b8%97%e0%b8%b2%e0%b8%87%e0%b9%80%e0%b8%82%e0%b9%89%e0%b8%b2%e0%b8%aa%e0%b8%b9%e0%b9%88%e0%b8%a3%e0%b8%b0%e0%b8%9a%e0%b8%9a-line-x-bet/ ) many publishers, was destroyed by bombing. [urlhttps://linexbet.app/%e0%b9%84%e0%b8%a5%e0%b8%99%e0%b9%8c%e0%b9%80%e0%b8%ad%e0%b8%81%e0%b9%80%e0%b8%9a%e0%b8%97-%e0%b9%80%e0%b8%84%e0%b8%a3%e0%b8%94%e0%b8%b4%e0%b8%95%e0%b8%9f%e0%b8%a3%e0%b8%b5/]ไลน์เอกเบท เครดิตฟรี[/url] Longman’s warehouse, containing the unsold copies of the novel,ไลน์เอ็กซ์เบด ( https://linexbet.app/%e0%b9%84%e0%b8%a5%e0%b8%99%e0%b9%8c%e0%b9%80%e0%b8%ad%e0%b9%87%e0%b8%81%e0%b8%8b%e0%b9%8c%e0%b9%80%e0%b8%9a%e0%b8%94/ ) was reduced to smoking rubble. O’Nolan would later claim that เกมสล็อตออนไลน์ ( https://linexbet.app/%E0%B9%80%E0%B8%81%E0%B8%A1%E0%B8%AA%E0%B8%A5%E0%B9%87%E0%B8%AD%E0%B8%95%E0%B8%AD%E0%B8%AD%E0%B8%99%E0%B9%84%E0%B8%A5%E0%B8%99%E0%B9%8C/ ) Hitler hated his work so much he had contrived the สล็อตเว็บตรง สปินฟรี ( https://linexbet.app/%e0%b8%aa%e0%b8%a5%e0%b9%87%e0%b8%ad%e0%b8%95%e0%b9%80%e0%b8%a7%e0%b9%87%e0%b8%9a%e0%b8%95%e0%b8%a3%e0%b8%87-%e0%b8%aa%e0%b8%9b%e0%b8%b4%e0%b8%99%e0%b8%9f%e0%b8%a3%e0%b8%b5/ ) second world war to stop it.เว็บตรงไม่ผ่านเอเยนต์ ( https://linexbet.app/%e0%b9%80%e0%b8%a7%e0%b9%87%e0%b8%9a%e0%b8%95%e0%b8%a3%e0%b8%87%e0%b9%84%e0%b8%a1%e0%b9%88%e0%b8%9c%e0%b9%88%e0%b8%b2%e0%b8%99%e0%b9%80%e0%b8%ad%e0%b9%80%e0%b8%a2%e0%b8%99%e0%b8%95%e0%b9%8c-linexbet/ )








       
    Для тех, у кого не установлена русская раскладка клавиатуры: кнопка "Транслит" перекодирует текст из латиницы в кирилицу. Текст в квадратных скобках "[]" не преобразуется. Остальные правила перекодировки здесь.
Дата последней модификации: 30/07/13

ГЛАВНАЯ · ПРОЕКТ · СПРАВОЧНИК · МЕТОДЫ · РАСТВОРЫ · РАСЧЁТЫ · ЛИТЕРАТУРА · ЗАДАЧИ · FULL TEXT · ОРГ.ВОПРОСЫ · WEB
ФИРМЫ · КАРТА САЙТА · COFFEE BREAK · КАРТИНКИ · РАБОТЫ И УСЛУГИ · БИРЖА ТРУДА · ФОРУМЫ · Выделите орфографическую ошибку мышью Рё нажмите Ctrl+Enter. Сделаем язык чище! · Zbio-wiki
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика      

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

molbiol.ru  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама

molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов   Rambler