Иммуноокрашивание срезов имаго (дрозофила)
приготовить 5-7µm срезы (см. "Фиксация и заливка в парафин (дрозофила). "), перенести кисточкой на предметное стекло в каплю воды;
сушить в термостате 37o С, ON.
депарафинировать в гистологических стаканах:
ксилол (I) => 5'2 O (mQ) => 1';
накапливать в стеклоприёмнике mQ, >2';
инкубировать 2х 5' в TBS в 100ml стеклоприемнике;
15' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
приготовить разведение первичных антител в TBSTB из расчета 100-150µl на стекло;
убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов (осторожно!) и нанести разведенные первичные антитела (~100-150µl на стекло);
инкубировать при NT 2h во влажной камере;
отмыть 2х10' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
приготовить разведения вторичных антител из расчета 100-150µl на стекло.;
убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов, нанести разведенные вторичные антитела, ассоциированные с пероксидазой;
инкубировать при NT 1h во влажной камере;
отмыть 2х5' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике.
растворить комплект из двух таблеток "Fast DAB" в 5ml H2 O, очистить: либо ЦФ NT, 5', либо фильтровать через 0.45µm фильтр;
нанести на каждое стекло ~200µl раствора Fast DAB;
следить за ходом реакции, сравнивая с контрольным препаратом (без первичных антител);
когда реакция достигнет насыщения, остановить, сполоснув в TBSTB.
~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат;
накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей;
осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость;
подсушить 5-10’ NT;
аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей;
препараты хранить при NT в темноте.
п. 1.
Срезы прикрепляются к предметному стеклу, обработанному polyL-lysine или TESPA "Обработка стекол. ".
п. 6.
Предокрашивание. Сыворотка из TBSTB предотвращает неспецифическое связывание первичных антител.
п. 8.
Жидкость вокруг срезов убирают для того, чтобы не растекался раствор антител.
п. 15.
Кит: Sigma, #D0426, "Fast DAB with metal enhancer".
п. 20.
Если пузыри всё же попали, то не надо пытаться их выдавить - поплывут и порвутся срезы, препарат испортится.
Смотри также: /ссылки на сетевые ресурсы/ 
MolBiol.ru >
Методы >
Иммуногисто.. > Белок на срезах взрослых мух
· 
Zbio-wiki
Дополнить