molbiol.ru -> Выделение ДНК из агарозного геля с помощью glass milk

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Выделение ДНК из агарозного геля с помощью glass milk -- comments to a permanent page of the site --

Тема связана с: С помощью glass milk
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Forum robot
Постоянный участник
на сервере в Москве

15.03.2006 15:44

URL #1

Комментарии к постоянной странице сайта: Выделение ДНК из агарозного геля с помощью glass milk

Метод можно использовать для выделения/очистки как двухцепочечной, так и одноцепочечной DNA. Он позволяет выделять фрагменты ~0.2-15kbp с эффективностью не менее 80%. Можно чистить DNA в водных растворах (между ферментативными реакциями). Описано приготовление Glass Milk.

Dimpler

15.03.2006 15:44

URL #2

Использовал готовый набор Fermentas. Каталожный номер K#0513. Работает очень плохо(фрагменты были ~700bp). Предпочиатю выделять ДНК из геля методом замораживания-размораживания в 0,5 мл эппендорфе с последующим протыканием дырочки в дне и центрифугированием. Если агароза мешает в дальнейшей работе, применяю переосаждение спиртом (EtOH и iProOH выходы дают примерно одинаковые).

Гость
IP-штамп: frsCQkPH3djzA
гость

26.03.2008 22:43

URL #3

PCR fragment purification with Glass Microfiber filter GF/A, Watman, Cat No 1820 037

1. Run 1.3 % agarose gel with PCR fragment and DNA lader marker.

2. Cut piece of glass filter and cover it with elution membrane from one side. They both should be the same size. I user “Spectarapor membrane tubing, M.W. cutoff 12 000 – 14 000 Dalton).

3. Make a hole in the agarose gel just in front of your PCR fragment and insert glass filter/ elution membrane in the hole. Glass filter face PCR fragment side.

4. TAE buffer should not over cover the gel. Pour out extra TAE buffer. Dry gel with paper towel.

5. Run gel for 5 more min at 108 V (your DNA from PCR fragment will be on your glass filter).

6. Place filter into 500ml tube. Make a cut in the bottom of the tube with a needle. Place this tube into 1.5 ml Epinforf tube. Centrifuge for 8 min 13 000 rpm.

7. Precipitate with 0.7 volume of iso-propanol. Centrifuge 15 min 13 000 rpm.

8. Wash with cold 70% ethanol. Let it dry. Dissolve in 20ml TE.

Gel: _ _ _

_ PCR fragment
------- glass filter
------- elution membrane

Storage of elution membrane.

Cut the elution membrane into 5 cm pieces. Cut off the edges of membrane. Boil for 30 min in H2O. Replace H2O to 1mM EDTA. Boil for 1 min. Store at 40 C up to 6 months.

Miss Marple
Участник
Москва vs. Европа

25.04.2008 12:29

URL #4

При использовании[Qiaex II] кита в нашей группе получается стабильно низкий выход продукта. Для коротких 1кб продуктов 40-60 процентов, для длинных >4кб 8-12 процентов.
Поиграли с временем для растворения агарозы, связвания и элюции - помогает, но незначительно. Чешем в затылке.

Pythonoid
Участник

29.06.2010 15:46

URL #5

У меня силика сильно слипается после ц/ф. Даже пипетируется с трудом.

В чем может быть проблема?
Выделяю геномную ДНК.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

29.06.2010 16:41

URL #6

--У меня силика сильно слипается
У вас перегрузка по ДНК.
Силки - мало, ДНК- много

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

29.06.2010 20:24

URL #7

(guest: ммм @ 29.06.2010 17:41)

--У меня силика сильно слипается
У вас перегрузка по ДНК.
Силки - мало, ДНК- много

ммм прав. Возможно, еще силика очень мелкая. Каким китом пользуютесь?

Pythonoid
Участник

30.06.2010 10:14

URL #8

(-Ъ- @ 29.06.2010 21:24)

ммм прав. Возможно, еще силика очень мелкая. Каким китом пользуютесь?

силика - сигмовская.
буферы - классические.

А Вы не в курсе как фракция частиц (1-10 мкм) влияет?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

30.06.2010 14:01

URL #9

чем мельче тем вязче.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

30.06.2010 14:43

URL #10

ммм, частично прав - есть силики мельче микрона, но плохо сорбирующие ДНК.
У Сигмы-Олдрджа несколько десятков силик(гелей) и ей подобных аналогов. Синтетических и природных, волокнистых и сферических и т д..
Говорите, буфера классические?

Pythonoid
Участник

01.07.2010 09:04

URL #11

(-Ъ- @ 30.06.2010 15:43)

Ну енто гуанидинистые) а не '90'

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

01.07.2010 11:11

URL #12

(Pythonoid @ 29.06.2010 16:46)

Можно попробовать уменшить скорость ЦФ до 2 тыс/мин, но увеличить время ЦФ до 1 мин. Пипетирование отменяется - только вортексирование.
С силикой Sigma S-5631 это обычная история ...

Pythonoid
Участник

01.07.2010 12:47

URL #13

(-Ъ- @ 01.07.2010 12:11)

А на что лучше заменить ее? На celite?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

01.07.2010 18:24

URL #14

-На celite?
Это почти песок, очень грубая фракция не нада на нее заменять.
Подходит селикагель от 10 до 20-50 микрон.

Поблагодарили (1): -Ъ-

RJ Dio
Постоянный участник

02.07.2010 14:06

URL #15

пардон, конечно, а на кой молочко всех мастей, если есть колонки? Давненько не пил молока (вообще, никто из млеков не потребляет в природе молока во взрослом состоянии), вспоминаю как страшный сон. колонки форева

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

02.07.2010 17:36

URL #16

(RJ Dio @ 02.07.2010 15:06)

С молоком вам не повезло в детстве.

По теории это одно и то же - что молоко, что колонки, что шарики магнитные, покрытие силикой. Как-нибудь подкину, всех трех видов киты, для испытания-сравнения всех трех видов, если не против, конечно.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

02.07.2010 17:43

URL #17

... ну что за жизнь все без молока да без молока...

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

03.07.2010 22:42

URL #18

А MN не проверял? рекомендую, для полного счастья.

anybody

18.07.2010 09:59

URL #19

А что это за штуковина такая?

www.diamond-dna.ru

кто-нибудь пробовал выделение днк ? это что челекс русский чтоли или что-то еще

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

18.07.2010 18:05

URL #20

(anybody @ 18.07.2010 10:59)

Не разобрался - сайт такой смешной.

Крутая оборонная разработка.

Похвально то, что пробники дают. Так что попробуйте и нам расскажете.

guest: ммм
IP-штамп: frKx.BJzj62lY
гость

18.07.2010 20:09

URL #21

--2. Адсорбция примесей, ингибирующих ПЦР с помощью сорбента (ДНК остается в растворе). Частицы сорбента имеют нанометровые размеры и не взаимодействуют с ДНК, что предотвращает ее механическую и химическую деградацию.

Судя по названию и проскакивающему лет 6-7 назад на форуме вопросу про нано алмазы и ДНК E.coli. Наночастицы это наноалмаз, получаемый взрывотехническим способом.

--3. Дополнительная очистка раствора осаждением белков (ДНК остается в растворе). Происходит дополнительная очистка ДНК от белков, полисахаридов и компонентов лизис-буфера.

Странно, но возможно ПЭГ.

--4. Осаждение и отмывка ДНК. Происходит селективное осаждение молекул ДНК высокоэффективным осадителем. Осаждающий буфер абсолютно нетоксичен и инертен; в отличие от спиртов, используемых для осаждения ДНК, не ингибирует ПЦР.

Скорее всего высокая соль, возможно ацетат магния или кальция

metrim
Постоянный участник
Москва

04.12.2016 19:27

URL #22

Можно ли заменить в данной методике NaI на KI ?

MMM
Постоянный участник

04.12.2016 20:28

URL #23

можно

genseq
Постоянный участник

04.12.2016 21:21

URL #24

А разработчики случайно не из Пущино?

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

05.12.2016 09:48

URL #25

(metrim @ 04.12.2016 20:27)

Можно ли заменить в данной методике NaI на KI ?

Нельзя. МММ - теоретик.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

05.12.2016 09:50

URL #26

(metrim @ 04.12.2016 20:27)

Можно ли заменить в данной методике NaI на KI ?

Кстати, о какой методике речь? Много воды утекло за 6 лет.
Агароза в КСI не плавится, даже при нагревании. Но самое главное - ДНК не липнет к сорбенту (силике) при высокой конц-ции КСI. Проверено собственноручно более 20 лет назад.

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 05.12.2016 10:47

genseq
Постоянный участник

05.12.2016 11:03

URL #27

МММ - правильный теоретик. Речь шла о замене NaI на KI, а не на KCl.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

05.12.2016 11:25

URL #28

(genseq @ 05.12.2016 12:03)

МММ - правильный теоретик. Речь шла о замене NaI на KI, а не на KCl.

Ах да...KI

ашибился

... пардон.
Прав был мой друг - в понедельник надо выходить на работу после обеда.

metrim
Постоянный участник
Москва

05.12.2016 11:40

URL #29

(-Ъ- @ 05.12.2016 10:50)

Кстати, о какой методике речь? Много воды утекло за 6 лет.

Ну вот собственно о методике по выделению ДНК из форезного геля , той что в разделе Методы и к которой дданная ветка - "коменты"

На хлорид калия я ничего менять и не собирался

Ну так иодид натрия на калий заменить без эффекта на работоспособность в буфере длф плавления можно?
Почему "если нет разницы" везде в методиках я вижу тока иодид натрия?

MMM
Постоянный участник

05.12.2016 12:08

URL #30

Я не сравнивал но KI может быть меньше растворимость и им просто не достичь нуной консентрасии(если не ошибаюсь 6,6М). Но по секрету скажу, что скажем калия роданид уже в 3М концентрации скорее всего растворит агарозку.

Сообщение было отредактировано MMM - 05.12.2016 12:44

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

05.12.2016 13:55

URL #31

Иодиды натрия и калия не удобны в работе. Высокомолярные растворы даже а темной посуде начинают желтеть (появление молекулярного иода). Приходилось добавлять к раствору кристаллики тиосульфата чтобы обесцветить. Потом плюнул и заменил его на гуанидина тиоцианат.
Протоколы на эту тему висят в инете, а самого Bio101 страницу не нашел. Видимо Кайджин сожрал с патрохами.

http://kirschner.med.harvard.edu/files/pro..._geneclean2.pdf
http://www.labnet.fi/doc/nucleic_acid_purification.pdf

Поблагодарили (1): genseq

ksm
Постоянный участник

07.12.2016 16:18

URL #32

а я, кстати, выделял с желтым NaI. особенных проблем не было...

R.J.Dio
Постоянный участник

11.12.2016 10:02

URL #33

(genseq @ 04.12.2016 22:21)

А разработчики случайно не из Пущино?

я бы не удивился. ТОгда по определению работать не должно

watchesbiz
Постоянный участник

23.11.2021 15:52

URL #34

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk

pullbase
Постоянный участник

07.02.2025 13:39

URL #35

The novel first appeared on linexbet 13 March 1939, but sold barely 200 copies in the LINE X BET first few months of publication. เว็บสล็อตออนไลน์ In 1940, Paternoster Row, ฝากถอนออโต้ ไม่มีขั้นต่ำ the London home of ทางเข้าสู่ระบบ LINE X BET many publishers, was destroyed by bombing. [urlhttps://linexbet.app/%e0%b9%84%e0%b8%a5%e0%b8%99%e0%b9%8c%e0%b9%80%e0%b8%ad%e0%b8%81%e0%b9%80%e0%b8%9a%e0%b8%97-%e0%b9%80%e0%b8%84%e0%b8%a3%e0%b8%94%e0%b8%b4%e0%b8%95%e0%b8%9f%e0%b8%a3%e0%b8%b5/]ไลน์เอกเบท เครดิตฟรี[/url] Longman’s warehouse, containing the unsold copies of the novel,ไลน์เอ็กซ์เบด was reduced to smoking rubble. O’Nolan would later claim that เกมสล็อตออนไลน์ Hitler hated his work so much he had contrived the สล็อตเว็บตรง สปินฟรี second world war to stop it.เว็บตรงไม่ผ่านเอเยนต์

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.